肺炎链球菌的转化缺陷导致细菌毒力减弱

的探讨肺炎链球菌的自然转化与其条件致病的关系。方法采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的转化缺陷菌株，通过黏附实验和小鼠毒力实验观察它们毒力的变化，应用RT-PCR测定黏附因子PsaA在野生和缺陷菌株中的表达。结果实验获得了3株肺炎链球菌(1、2和22)的转化缺陷菌株(1d、2d和22d)。毒力研究发现转化缺陷菌株对ECV 304细胞的黏附能力显著弱于相应的野生菌株，1和2株肺炎链球菌腹腔感染BALB／c小鼠的能力显著强于相应的转化缺陷菌株；研究还发现PsaA基因在2和22株肺炎链球菌中的表达量显著高于其缺陷菌株。结论肺炎链球菌具有自然转化的能力有助于其毒力的表现，且可能通过黏附因子PsaA等相关毒力因子表达增加而增强其毒力。     

肾素-血管紧张素基因多态性与左心室质量构象及功能相关性的研究现状

肾 素 血管紧张素系统 (RAS)在高血压及其他心血管疾病的发生发展中起重要的作用。人类血管紧张素转换酶、血管紧张素原、血管紧张素Ⅱ一型受体基因染色体定位以及克隆成功 ,为其在心血管疾病病因学研究确立了分子生物学基础。目前高血压病研究的三大前沿领域包括 :寻找新的导致高血压病基因 ;阐明导致高血压靶器官损伤的基因易感性 ;抗高血压药物的药物基因学。高血压病被认为是一种多基因遗传病 ,同时与环境因素关联。基因在高血压相关的靶器官疾病的发生发展中的作用效应 ,可能由以下三个途径完成。 ( 1)基因不直接影响血压变化 ,但是…     

肺炎链球菌粘附肺Ⅱ型上皮细胞触发宿主细胞酪氨酸蛋白磷酸化

目的 探讨细胞内信号传导与肺炎球菌侵袭、致病的关系,在体外研究Ⅱ型肺炎链球菌粘附肺Ⅱ型上皮细胞（A549）是否能触发细胞内酪氨酸蛋白激酶（TPK）信号传导途径 ,以及触发该信号传导可能的细菌亚组分。方法 用FTTC荧光标记肺炎链球菌,在体外观察肺炎链球菌粘附肺Ⅱ型上皮细胞的粘附动力学特征;用免疫组织化学和ELISA方法观察完整细菌触发的细胞内酪氨酸蛋白磷酸化,用各种因素预处理肺炎链球菌后,观察触发细胞内酪氨酸蛋白磷酸化可能的细菌亚组分。结果 证实了上述粘附过程存在剂量依赖和时间的依赖关系,而且是特异的过程;细菌粘附使细胞内酪氨酸磷酸化由细菌表面蛋白质介导。结论 肺炎链球菌粘附肺Ⅱ型上皮细胞能触发细胞内信号传导,且细菌表面蛋白质在触发胞内酪氨酸蛋白磷酸化传导中起着重要作用。     

Cys C的原核表达载体构建和鉴定

目的:构建人胱抑素C(Cys C)的原核表达载体,为进一步表达纯化Cys C重组蛋白奠定基础.方法:从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,再将目的基因克隆至PET32a( )表达载体中,构建人Cys C原核表达质粒PET32a( )/Cys C;再将此重组子进行双酶切电泳鉴定和测序鉴定.结果:酶切电泳鉴定结果显示Cys C基因克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符.结论:获得了人Cys C原核表达质粒PET32a( )/Cys C,为进一步表达和纯化Cys C重组蛋白奠定了工作基础.     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0414亚细胞定位及对细菌黏附侵袭的影响

目的 为研究肺炎链球菌假想蛋白SPD0414在肺炎链球菌(S.pn)的亚细胞定位,并初步研究其在S.pn黏附和定植中的作用.方法 通过分别在SPD0414的N端和C端融合绿色荧光蛋白(GFP),共聚焦荧光显微镜观察定位情况.用203野生菌和203△spd0414缺陷菌对鼻咽癌细胞CNE和肺腺癌细胞A549细胞的黏附侵...     

肺炎链球菌溶血素的体外表达及活性鉴定

目的 体外扩增肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)的溶血素(pneumolysin,ply)基因,在大肠杆菌中高效表达,并验证其生物活性.方法 分离培养D39型肺炎链球菌并提取其基因组DNA,采用PCR技术体外扩增ply基因,体外重组将ply序列克隆到原核表达载体pET28(a)内,测序鉴定后将重组子转化到E.coli Rosetta(DE3)中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的Ply重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白经SDS-PAGE鉴定后检测其溶血活性和细胞毒性.结果 克隆的ply序列与GenBank中的数据相符,并实现了Ply蛋白的可溶表达.所获重组蛋白纯度达到95%.溶血实验显示 Ply对人红细胞具有极高的溶血活性,与对照组相比较差异有统计学意义(P＜0.05),并呈剂量依赖.细胞毒实验显示Ply对脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)细胞具有明显抑制作用,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05),并呈剂量与时间依赖性,IC50(24h)为1.525 μg/ml.结论 经测序鉴定ply基因正确扩增,并成功表达、纯化出具有高溶血活性和细胞毒性的Ply蛋白.     

肺炎链球菌疫苗候选蛋白质谷氨酰胺tRNA合成酶的保守性与抗原性分析

目的分析作为肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)疫苗候选靶点的谷氨酰胺tRNA合成酶(glutamyl tRNA syn-thetase,Gts)的保守性和抗原性,并评价Gts抗原诱导产生的抗体在体内是否存在年龄依赖性。方法 PCR扩增S.pn D39标准菌株的Gts基因,构建pET32a(+)-Gts原核表达质粒并测序。扩增S.pn不同血清型的Gts基因,测序后比对分析其保守性。表达Gts重组蛋白质,并进行纯化和western blot鉴定。用Gts重组蛋白质免疫BALB/c小鼠制备抗Gts的多克隆抗体并测定其效价。western blot分析Gts在不同血清型S.pn中的表达情况。ELISA法测定本地区不同年龄段的健康人及患者血清中抗Gts抗体的效价。结果构建了以D39血清型S.pn为DNA模版的pET32a(+)-Gts表达质粒,其测序结果与预期相符。8株不同血清型S.pn的Gts基因编码区大小与D39菌株一致,约为1 461 bp;经测序后序列比对,其基因一致性>99.0%。经Ni柱纯化得到纯度>95%的Gts重组蛋白质,且能与抗His tag标签抗体特异性结合。采用Gts蛋白质经腹腔免疫小鼠后,其血清抗Gts抗体滴度高达1.024×106(5.12×105,4.096×106),与对照组比较有显著差异(P<0.01)。western blot分析证实,8种不同血清型S.pn全菌裂解物均在Mr约55.9×103处出现特异性反应条带。在不同年龄段的健康人群及患者血清中,均产生高滴度的抗Gts抗体,且随着年龄增加而递增。结论 Gts重组蛋白质免疫原性好,在不同血清型的S.pn中均高度保守,且诱导产生的抗体反应存在年龄依赖性,是一个良好的候选疫苗靶点。     

颗粒增强免疫透射比浊法检测血清高半胱氨酸

目的建立测定血清中高半胱氨酸(Hcy)的颗粒增强免疫透射比浊法。方法血清Hcy经S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)与腺苷转化为S-腺苷高半胱氨酸(SAH),用抗SAH抗体与转化后SAH以及胶乳颗粒结合的SAH先后反应,根据生成免疫复合物的变化值计算出SAH浓度;依据美国CLSI标准和指南性文件,对方法进行评价。结果建立的方法检测范围为3.0～53.0μmol/L,最低检测限0.6μmol/L;批内不精密度1.00%～2.09%;日间不精密度4.69%～5.44%;方法回收率为97.3%～105.6%;Vit-C≤1 000 mg/L、胆红素≤400μmol/L、乳糜≤0.8%、Hb≤6.0 g/L对测定结果无显著性干扰;参考值为<15.5μmol/L;与高效液相色谱(HPLC)法相关性良好(r=0.994,P<0.01),测定结果无显著性差异。结论建立的方法可用于临床实验室检测血清Hcy浓度。     

鼻腔滴注法建立小鼠肺炎链球菌性脑膜炎模型

目的鼻腔滴注法建立小鼠肺炎链球菌性脑膜炎模型,为研究肺炎链球菌致脑膜炎的分子机制奠定基础。方法将冻存的TIGR4在新鲜TSA血平板上培养16 h～18 h后,刮取细菌并稀释成3种不同密度的菌液,每种密度分成2份,其中1份加入一定量的透明质酸酶,另1份不加。对小鼠行浅麻醉,用卡介苗注射器将上述菌悬液缓缓滴入小鼠鼻腔,待其自动吸入,每只小鼠50μl。每天观察小鼠情况,分别于感染后24、48和72 h处死小鼠,取心脏血和一半脑组织匀浆,做细菌计数,另一半脑组织用于组织病理学检查。结果加透明质酸酶的TIGR4 3个剂量组小鼠脑膜炎发生率分别为20.00%、65.00%和46.67%,对照组分别为13.33%、53.33%和66.67%,差异无统计学意义(P= 1.000 0);其中3×10~7CFU组和3×10~8CFU组差异无统计学意义(P=0.462 1),两组合并后与3×10~6CFU组差异有统计学意义(P=0.0196)。结论1)透明质酸酶不能促进鼻腔滴注TIGR4致小鼠脑膜炎的发生;2)小鼠脑膜炎的发生率与鼻腔感染TIGR4剂量有关,适宜剂量为3×10~7CFU,低于该剂量脑膜炎的发生率显著降低。