PPARG基因单核苷酸多态性与2型糖尿病血脂异常的相关性研究

目的研究PPARG基因单核苷酸多态性(SNPs)与中国汉族2型糖尿病(DM)及血脂异常的关系。方法测定593例2型DM患者及626名正常健康者SNPs rs1801282、rs12636454和rs11128597基因型,分析其与2型DM及血脂水平的关系。基因分型采用单碱基延伸法(SBE)。结果2型DM组SNPs rs1801282、rs12636454和rs11128597基因型及等位基因频率分布与对照组间差异均无统计学意义(P>0.05)。2型DM组中rs1801282 AB+BB基因型总胆固醇(TC)、血糖和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平显著高于AA基因型(P均<0.01)。rs12636454 AA基因型三酰甘油(TG)水平高于AB+BB基因型(P<0.05)。rs11128597 AA基因型血糖水平高于AB+BB基因型(P<0.01)。结论PPARG基因与中国汉族人2型DM无直接相关,但可能参与2型DM的血糖水平和脂质代谢的调节。     

clpE缺陷对肺炎球菌蛋白表达的影响

目的 了解ClpE对肺炎球菌蛋白表达的影响.方法 用长臂同源多聚酶链式反应(LFH-PCR)方法失活clpE基因,用PCR、测序鉴定缺陷菌株;通过固相pH梯度双向凝胶电泳(2D-PAGE)分别分离野生菌和clpE缺陷菌的总蛋白质;经凝胶银染色、PDQuest 2DE软件分析获得 2个菌株的蛋白质表达谱;选取差异蛋白质点进行MEDLI-TOF质谱分析,查询数据库,获取有意义的蛋白点.结果 以肺炎链球菌D39的图谱为参考,△clpE与其匹配率为61%.挑选17个有明显差异表达的蛋白点进行MALDI-TOF-MS分析,获得了17张肽质量指纹图,经数据库查询后,4个蛋白点获得了有意义的结果,分别为:次黄嘌呤鸟嘌呤核糖核酸转移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase),吡咯烷羧酸肽酶(pyrrolidone-carboxylate peptidasel),甲酸四氢叶酸连接酶(formate-tetrahydrofolate ligase)和双功能蛋白pyrR (bifunctional protein pyrR).结论 野生菌表达蛋白的种类和数量均高于突变菌株,提示clpE可通过影响某些特殊蛋白质的表达,帮助细菌适应宿主的不同环境,使宿主致病.

Abstract：

Objective To investigate the effect of ClpE on the protein expression profiles of Streptococcus pneumoniae.Methods clpE-deficient Streptococcus pneumoniae strain was constructed by long flanking homology-polymerase chain reaction (LFH-PCR) and identified by PCR and sequencing. The total bacterial proteins were analyzed by two-dimensional gel electrophoresis and imaging analysis, and the differentially expressed protein spots were excised by dot-gel digestion with trypsin. Peptide mass fingerprinting (PMF) was obtained by analysis of the fragment length by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). The PMF was analyzed using software to identify the proteins. Results The number of matched protein spots of the two gels was 61%. By sequence database searching, 4 out of the 17 differential protein spots were identified, namely hypoxanthine-guanine, pyrrolidone-carboxylate peptidasel,formate-tetrahydrofolate ligase, and bifunctional protein pyrR. Conclusion clpE gene-deficient Streptococcus pneumoniae expresses fewer kinds of proteins at also lower levels than the wild-type bacteria, suggesting that ClpE allows the bacteria to adapt to different host environments by inducing the expression of special proteins.     

肺炎链球菌MarR家族蛋白SPD_0379通过调节基因rafX的表达调控磷壁酸的合成

目的：明确肺炎链球菌MarR家族蛋白SPD_0379对细菌磷壁酸（teichoic acids,TA）的调控作用。方法：通过凝胶阻滞实验验证SPD_0379蛋白与rafX基因启动子序列的结合,通过LacZ报告基因观察细菌在spd_0379基因缺陷后的rafX基因表达变化,通过斑点杂交、ELISA和流式细胞术检测细菌磷壁酸的含量变化,通过生长曲线分析揭示SPD_0379蛋白在细菌生长中的作用。结果：SPD_0379蛋白与rafX基因启动子序列发生特异性结合,spd_0379基因缺陷后,细菌的rafX基因表达上调（t=10.010,P=0.001）,免疫斑点与ELISA均显示磷壁酸含量明显升高（t=5.848,P=0.004;t=4.653,P=0.001）,且缺陷菌的自溶较野生菌明显提前。结论：SPD_0379蛋白负调控rafX基因的表达,抑制细菌磷壁酸的合成,参与细菌自溶的调控。     

肺炎链球菌comX基因可影响细菌毒力基因表达

目的:探讨肺炎链球菌的转化相关基因comX与其毒力表达的关系.方法:采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株,通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化,并应用RT-PCR测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶(phd),分泌型IgA结合蛋白(sIgA),肺炎链球菌自溶酶(lytA),肺炎链球菌神经氨酸酶A (nanA)和肺炎链球菌溶血素(ply)在细菌感受态发生过程中的表达,并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同.结果:野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子(CSP)诱导表达增加;虽comX基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异,但其ply基因的表达与comE基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达.结论:comX可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达.     

人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶单克隆抗体的制备及鉴定

目的 通过构建人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶(ALT1)的原核表达载体,并用纯化的ALT1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备有生物活性的单克隆抗体.方法 用GST-ALT1融合蛋白作为免疫原,通过杂交瘤技术制备抗ALT1的单克隆抗体,用间接ELISA、Dot-Elisa、Western blot等方法对抗体的抗原结合特性进行鉴定.结果 获得1株能稳定分泌抗ALT1单克隆抗体的细胞株8A9,亚类鉴定这种单抗为IgG2.间接ELISA法测定细胞株腹水抗体的效价为10×10~5.Dot-ELISA、Western blot显示ALT1单克隆抗体能特异性地识别免疫原.结论 成功制备ALT1单克隆抗体.     

肺炎链球菌绿色荧光蛋白报告质粒的构建及评价

目的：构建一个可高效报告基因表达的绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP）报告质粒,为采用差异荧光诱导（Differential fluorescence induetion,DFI）技术筛选肺炎链球菌（Streptoccus pneumoniae,S．pn）体内诱导的毒力基因奠定基础。方法：酶切质粒pGreenTIR的SD-ENH-GFP片段,将其插入含氯霉素抗性基因的自杀质粒pEVP3中,构建以绿色荧光蛋白为报告基因的自杀质粒pEVP3-SDGFP。再将肺炎链球菌的溶血素基因（Pneumolysin,ply）上游约500bp片段插入到该质粒报告基因上游的多克隆位点中,得到质粒pEVP3-SDGFP-Ply,将其转化入肺炎链球菌TIGR4中,比较新建质粒pEVP3-SDGFP与同样处理质粒pEGFP-1（报告基因gfp前无SD及ENH序列）报告上游基因表达的情况。结果：通过体内、外实验证实新建质粒pEVP3-SDGFP不但可以报告肺炎链球菌溶血素基因的表达,并且其报告上游基因表达的能力明显强于质粒pEGFP-1。结论：所构建的质粒pEVP3-sDGFP可用于DFI筛选肺炎链球菌体内诱导基因所需启动子诱捕文库的构建。     

46株肺炎链球菌的血清型别和毒力因子基因的保守性分析

摘要：目的：研究临床分离的肺炎链球菌菌株的血清型和重要毒力因子碱基序列的保守情况,为临床肺炎链球菌疫苗的使用和蛋白质疫苗的研发提供参考依据。 方法：收集2010~2013年重庆医科大学附属儿童医院11岁以下儿童中分离的46株肺炎链球菌,用多重PCR进行血清型分型。同时PCR扩增肺炎链球菌的11个毒力基因ply、lytA、nanA、phtD、clpP、cps2A、bacteriocin、psaA、piaA、pcsB和stkP,测序后分析碱基序列的突变情况。 结果：46株肺炎链球菌共检出13种血清型,其中19A（19.57%）为最常见的血清型,其次为23F和19F(各占15.22%)。临床菌株毒力基因ply、lytA、nanA、phtD、clpP、cps2A、bacteriocin、psaA、piaA、pcsB和stkP的碱基序列保守性分别为97.82 %、96.31 %、82.96 %、87.50 %、98.48 %、83.68 %、66.27 %、99.46 %、98.63 %、88.72 %和96.67 %。 结论：在重庆地区儿童感染的肺炎链球菌中,血清型19A分布比例最高,本地区儿童接种肺炎链球菌疫苗时应首选含有19A血清型荚膜多糖抗原的PCV13疫苗。毒力因子ply、stkP、piaA、lytA、clpP和psaA基因在临床菌株中保守性较高,具有作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白质的潜力。     

基因芯片在感染性疾病研究中的应用

人类基因组计划、病原体基因组测序的完成，以及基因芯片技术的出现，为研究感染性疾病的致病分子开拓了新的天地。基因芯片技术因具有检测快速、高效、并行等特点，加速了对微生物和宿主之间复杂的遗传学过程的认识，有利于发现病原体毒力相关基因和宿主防御策略，从而有助于感染性疾病的诊断、治疗和预防。     

肾素-血管紧张素系统基因多态性与原发性高血压左心室肥厚关系的探讨

目的　探讨肾素 血管紧张素系统 (RAS)基因多态性与原发性高血压左心室肥厚 (EH LVH)的相关性以及在EH LVH产生中的多基因协同作用。方法　对 10 9例原发性高血压病 (EH)患者 ,采用聚合酶链反应 (PCR)以及聚合酶链反应 限制性片段长度多态性方法检测血液白细胞染色体DNA中血管紧张素转换酶 [ACE(I D) ]、血管紧张素原 [AGT(M2 35T) ]和血管紧张素Ⅱ 1型受体 [AT1 R(A116 6C) ]基因多态性 ;利用超声心动图检测左心室质量 (LVM)并计算左心室质量指数 (LVMI)。结果　ACE(I D)基因多态性D等位基因频率在EH LVH组中明显增高 (χ2 =4 .6 9,P=0 .0 30 ) ,男性EH患者中 ,ACE(I D)基因型构成比与LVH有关联 (χ2 =9.5 5 ,P =0 .0 0 8)。协同存在AGT TT型时 ,ACE(I D)基因多态性与EH LVH有关 (χ2 =6 .2 2 ,P =0 .0 4 4 ) ,且D等位基因在EH LVH明显增高 (χ2 =6 .91,P =0 .0 0 9) ,该类EH患者发生LVH的相对危险度增高 (OR :2 .5 0 ,95 %CI:1.2 5～ 5 .0 0 )。结论　ACE(I D)基因多态性D等位基因可能是LVH的独立危险因子。ACE基因多态性与AGT基因多态性之间的协同效应表明 ,同时携带AGT TT型时 ,具有ACE(I D)基因多态性D等位基因的EH患者更易发生LVH。     

肺炎链球菌在体外触发人肺Ⅱ型上皮细胞F-actin细胞骨架重排

目的　通过体外实验研究肺炎链球菌 (Streptococcuspneumoniae ,S .pn)侵袭A54 9细胞和微丝肌动蛋白细胞骨架重排之间的关系。方法　采用F actin特异性FITC phalloidin荧光染料 ,观察S .pn作用于A54 9细胞前后的F actin细胞骨架重排情况 ;用F actin细胞骨架重排抑制剂———细胞松弛素D预处理A54 9细胞 ,观察S .pn对A54 9细胞的侵袭率 ;分别使用PLC、TPK信号转导抑制剂U7312 2、Genistein处理因素预处理A54 9细胞 ,观察其与F actin细胞骨架重排的关系。结果　S .pn作用A54 9细胞后 ,F actin细胞骨架呈块状、丝状聚集 ;F actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D可明显降低S .pn对A54 9细胞的侵袭率 ,在其浓度为 0 .2 5 μg ml时 ,未得到可测的细菌数 ;PLC(磷脂酶C)、TPK(酪氨酸蛋白激酶 )信号转导途径抑制剂可部分抑制A54 9细胞F actin细胞骨架重排 ,其相关系数分别为 :rPLC =- 0 .88(P <0 .0 5 ) ;rTPK =- 0 .91(P <0 .0 5 )。S .pn细胞壁作用A54 9细胞后 ,F actin细胞骨架呈块状、丝状聚集 ,二者间存在剂量依赖关系。结论　S .pn可通过PLC、TPK细胞信号转导途径触发A54 9细胞F actin细胞骨架重排 ,进而导致S .pn侵袭A54 9细胞。