肺炎链球菌实验室转化模型的方法学研究

目的 建立肺炎链球菌的实验室转化模型,以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造。方法 通过检测细菌的吸光度值,在特定的菌密度时利用感受态刺激因子(CSP)诱导,采用血平板培养筛选的方法,获取发生转化了的菌株。通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化。结果 发现不同肺炎链球菌株的转化最适菌密度不同,构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株,建立了肺炎链球菌在实验室的转化模型。结论 实验室条件下,在不同菌密度时可利用CSP诱导肺炎链球菌成为感受态而发生转化。     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

肺炎链球菌感受态缺陷影响细菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性

目的　探讨肺炎链球菌在对抗 β 内酰胺类抗生素时是否受感受态形成的影响。方法通过转化得到感受态缺陷菌株 ,采用半定量RT PCR检测相关基因ciaH和cpoA在细菌感受态形成时的表达 ,用肉汤法检测各菌株的最低抑菌浓度 (MIC)。结果　细菌感受态时基因ciaH和cpoA的mRNA表达量增高 (P <0 .0 5 ) ,野生菌感受态缺陷后的MIC值发生改变。结论　肺炎链球菌的感受态形成可诱导ciaH和cpoA的表达增加 ,其感受态缺陷影响到其对 β 内酰胺类抗生素的敏感性 ,但不同菌株的影响不同。     

肺炎链球菌感受态的形成影响毒力因子mRNA的表达

目的：通过体外实验诱导的转化过程，探索肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae,S.pn)毒力因子的表达是否与环境诱导细菌感受态形成与转化有关。方法：采用插入失活的方式断裂S.pn感受态形成的关键基因comE，获得感受态缺陷菌株。以实时定量RT－PCR测定毒力因子在感受态缺陷菌与野生菌的表达是否存在差异。所测毒力因子有自溶酶、溶血素、胆碱结合蛋白、S-IgA、神经氨酸酶、透明质酸酶。结果：S.pn在540nm处吸光度（A）值＝0.044－0.127之间产生感受态。自溶酶、神经氨酸酶、透明质酸酶3种毒力因子的表达，野生菌组表达高于缺陷菌组，两均数间比较的t值分别为2．96（P＜0．05）、2．8（P＜0．05）、4．56（P＜0．05）。结论：细菌感受态能启动自溶酶、神经氨酸酶、透明质酸酶3种毒力因子的表达，提示S.pn的感受态能影响其毒力因子的表达。     

肺炎链球菌表面蛋白在细菌体外粘附中的介导作用

目的在体外研究肺炎链球菌表面蛋白对细菌粘附于宿主细胞的介导作用。方法用ＦＩＴＣ荧光标记肺炎链球菌（ＳⅡ、ＳⅢ），用蛋白质合成抑制剂，ＲＮＡ合成抑制剂和神经氨酸酶分别处理肺炎链球菌和小鼠腹腔巨噬细胞后，在体外观察这些因素对细菌与巨噬细胞粘附率的影响；另外观察细菌细胞壁提取物对上述粘附率的影响。结果证实了粘附过程存在剂量依赖和时间依赖的关系，是特异的粘附过程。用多因素分别处理肺炎链球菌和巨噬细胞后，其粘附率的改变与肺炎链球菌合成ＲＮＡ和蛋白质有关，需要肺炎链球菌识别巨噬细胞表面糖蛋白结构的受体。肺炎链球菌可溶性细胞壁成分能与完整肺炎链球菌同样有对巨噬细胞的粘附，去蛋白细胞壁成分则无此作用。结论提示细菌表面蛋白介导了这一粘附过程。     

肺炎链球菌毒力因子PspA的原核表达、纯化及鉴定

目的:通过构建原核表达载体,获得肺炎链球菌毒力因子PspA重组蛋白.方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将PspA序列克隆到原核表达载体PET-32(a)上,用酶切及测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,进行蛋白纯化,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果:克隆的DNA序列与GenBank中的数据相符,获得的重组蛋白PspA纯度达到90%.结论:成功表达和纯化了PspA,为肺炎链球菌多肽联合疫苗研制和该蛋白的结构生物学分析奠定了基础.     

肺炎链球菌实验室转化模型的方法学研究

目的 建立肺炎链球茵的实验室转化模型，以便于对该茵的各种目的基因进行重组改造。方法 通过检测细菌的光妻当竺，皇冀定的茵密度时利用感受态刺激因子(CSP)诱导，采用血平板培养筛选的方法，获取发生转化了的菌株。通过抗生素培养基和PCR鉴定是否发生转化。结果 发现不同肺炎链球菌株的转化最适茵密度不同，构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株，建立了肺炎链球菌在实验室的转化模型。结论 实验室条件下，在不同茵密度时可利用CSP诱导肺炎链球菌成为感受态而发生转化。     

体内表达细菌毒力基因分析

面对复杂的宿主环境,细菌在体内是通过调节表达不同的毒为基因建立并延续其感染过程的。目前已建立起多种方法去分析鉴定体内特异表达的细菌毒力基因。其中体内表达技术的应用力为鉴定细菌毒为基因以及揭示细菌致病机理开辟了有力的途径。本文对此作一综述。     

体内表达细菌毒力基因分析

面对复杂的宿主环境 ,细菌在体内是通过调节表达不同的毒力基因建立并延续其感染过程的。目前已建立起多种方法去分析鉴定体内特异表达的细菌毒力基因。其中体内表达技术的应用为鉴定细菌毒力基因以及揭示细菌致病机理开辟了有力的途径。本文对此作一综述。     

肺炎链球菌触发肺Ⅱ型上皮细胞微丝肌动蛋白重排的钙信号转导机制

目的 通过体外实验研究肺炎链球菌(S.pn)是否可通过肺型上皮细胞(A549)钙信号转导途径触发微丝肌动蛋白(F-actin)细胞骨架重排,进而导致S.pn对A549细胞的侵袭。方法 采用F-actin特异性FITC-phalloidin荧光染料,观察S.pn作用A549细胞前后F-actin细胞骨架重排情况,以重排百分率表示;用F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D预处理A549细胞,观察S.pn对A549细胞的侵袭;使用Ca²⁺信号转导抑制剂dantrolene预处理A549细胞,观察其与F-actin细胞骨架重排百分率间是否存在剂量依赖关系;用Fura-2/AM荧光探针负载A549细胞后测定S.pn粘附A549细胞30、60、90 min的胞内[Ca²⁺]_i。结果 S.pn作用A549细胞后,经FITC-phalloidin荧光染色,F-actin细胞骨架呈黄绿色块状聚集;F-actin细胞骨架重排抑制剂细胞松弛素D可明显降低S.pn对A549细胞的侵袭,在其浓度为0.25 μg/ml时,未得到可测的细菌数;Ca²⁺信号转导抑制剂可部分抑制A549细胞F-actin细胞骨架重排,且与F-actin细胞骨架重排百分率间存在量效关系;S.pn粘附A549细胞30、60、90 min后的胞内[Ca²⁺]_i高于对照[(187.4±17.3 nmol/L)],并达到饱和,分别为(487.5±38.1)、(548.2±35.6)和(557.2±47.5)nmol/L。结论 S.pn可通过Ca²⁺细胞信号转导途径触发A549细胞F-actin细胞骨架重排,进而导致S.pn侵袭A549细胞。