蛋白质凝胶电泳银染色法的改进

目的探索一种快速、灵敏的蛋白质凝胶电泳银染色方法。方法对蛋白质凝胶电泳银染色过程中的多种因素进行了实验探索。在此基础上探索出一种改良的蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色法。结果改进方法灵敏度为Coomassie Brilliant Blue R-250法的100倍以上，对牛血清白蛋白的检测限在0．5ng以下，整个染色过程不超过60min，染色重复性好。结论改进后的方法比以前使用的方法简便、快速、灵敏、成本相对低廉。     

一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

HBV cccDNA荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:评估一个新设计的HBV cccDNA荧光定量PCR检测方法.方法:以肝穿组织为检测标本,采用LightcycleTM探针,通过一对特殊引物,使HBVcccDNA可以扩增而病毒基因组不能扩增;同时利用一种依赖于ATP的特异性DNase提高反应的特异性,以此实现对cccDNA的检测.结果:成功建立了HBV cccDNA荧光定量PCR的检测方法,线性范围为2.5×101～2.69×109拷贝/ml.对5个病例的肝穿样本进行分析,其中3例为乙肝感染患者,并均接受抗病毒治疗达1年,另2例为乙肝阴性患者.检测结果如下:1)2例乙肝阴性患者的肝组织检测结果cccDNA及tDNA皆为阴性.2)接受拉米夫定治疗1年的病人tDNA为7.10×103拷贝/ml,cccDNA为2.64×103拷贝/ml;接受恩替卡韦治疗1年的病人tDNA为1.00×105拷贝/ml,cc-cDNA为4.04×103拷贝/ml;第3例病人接受拉米夫定治疗前tDNA为6.62×103拷贝/ml,cccDNA为3.03×102拷贝/ml,拉米夫定治疗1年后tDNA为5.19 × 103拷贝/ml,cccDNA为1.51×102拷贝/ml.结论:本研究结果显示,所建立的HBVcccDNA荧光定量PCR方法具有良好的线性范围,灵敏度、特异性及准确性均达到预期目标,而且检测所需样本量少,只需约1mg肝穿组织.可作为临床监测抗病毒治疗效果的有效手段和开展HBV复制调控研究的重要工具.     

环境军团菌的分离培养及鉴定方法探讨

目的 建立地表环境水军团菌的分离培养及种属鉴定方法.方法 在广州市内8个公园中采取了44份地表湖泊水样,进行军团菌的分离培养.同一湖泊来源的分离株以扩增片段长度多态性(amplifled fragment length polymorphism,AFLP)进行同源性分析;进一步的种属鉴定采用生化血清学鉴定、细胞脂肪酸成分分析、16 S rRNA基因测序、巨噬细胞感染增强蛋白(mip)基因测序等多种手段相结合的方法进行分析和比较.结果 8个公园内的27份水样分离出军团菌,阳性率为61.36%.初步分离的108个菌株,经AFLP同源性鉴定,得到不同菌株31株,包括嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)20株,橡树岭军团菌(Legionella oakridgensis)1株,圣海伦军团菌(Legionella sainthelensi)1株,长滩军团菌(Legionella longbeachae)4株,菲氏军团菌(Legionella feeleii)5株.其中,嗜肺军团菌可直接通过常规的生化实验、血清学鉴定得到种属鉴定结果.但包括细胞脂肪酸成分分析在内的表型鉴定方法,均存在不同程度的不稳定性因素.结论 生化实验、血清学鉴定、细胞脂肪酸成分分析等能够为军团菌的分类学鉴定提供有价值的资料,但最终的种属鉴定仍必需依赖于16 SrRNA基因或mip基因的序列分析.     

用融合蛋白在大肠杆菌中高表达百日咳杆菌毒素蛋白S＿3亚基基因

用多聚酶链反应（ＰＣＲ）和基因重组技术通过百日咳毒素Ｓ＿３亚基基因和高表达质粒ｐＭＡＬ－Ｃ构建了麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）和（Ｓ＿３）亚基蛋白的融合基因，并在大肠杆菌中高效表达了（ＭＢＰ－Ｓ＿３）融合蛋白。该融合蛋白产率占细胞总蛋白含量的２５％，并且能用蛋白酶因子Ｘａ将融会蛋白切开，得到ＭＢＰ（４２ＫＤ）和Ｓ＿３亚基蛋白（２１．８７ＫＤ）．该方法表达式效率高。纯化过程简单，为基因工程技术生产该毒素提供了新的途径。     

体液端粒酶检测在恶性肿瘤诊断中的应用进展

体液端粒酶活性检测因其标本来源方便、创伤性小已成为当令肿瘤分子生物学研究的一个新的靶点。本文对端粒酶活性的检测方法及各种体液标本包括腹水/胸腔积液、支气管冲洗/灌洗液、尿液/膀胱冲洗液、血浆/血清端粒酶活性检测对恶性肿瘤的诊断价值进行了综述。     

干化学法建立重庆地区健康儿童肝功能指标参考区间值的横断面调查

目的 通过干化学法建立重庆地区3月龄至18岁健康儿童适合年龄和性别的8项肝功能指标参考值。方法选择3月龄至18岁健康儿童,根据年龄分为5组。采用美国强生公司VITROS 5600干化学分析仪检测8项肝功能指标:血清总胆红素(TB)、总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酰转肽酶(GGT)和乳酸脱氢酶(LDH),比较不同年龄和性别各项肝功能指标的差异,采用非参数方法计算参考区间。结果 研究期间3 758名3月龄至18岁健康儿童符合纳入和排除标准,剔除35份不合格标本,3 723份合格标本纳入分析。3月龄至1岁组241份,～3岁组251份,～6岁组939份,～12岁组1 672份,～18岁组620份。①～3岁组TP和ALT,～6岁组TP和AST,～12岁组TB、ALT、AST、GGT和LDH,～18岁组TB、ALB、ALT、AST、ALP、GGT和LDH检测结果均为男高于女,差异有统计学意义(P均<0.05)。②ALT、AST和LDH检测结果与年龄呈负相关,TB、TP、ALB、ALP和GGT检测结果与年龄呈正相关。③8项肝功能指标参考区间为TB(μmol·L^-1):3月龄至1岁组1.0~11.0,～18岁组1.0~16.3;TP(g·L^-1):3月龄至3岁组60.2~74.2,～6岁组61.3~78.2,～12岁组62.8~81.5,～18岁组64.9~82.4;ALB:3月龄至18岁组38.4~49.5 g·L^-1;ALT(U·L^-1):3月龄至1岁组15.8~48.4,～12岁组14.0~42.2,～18岁组男14.7~45.7、女12.5~44.8;AST(U·L^-1):3月龄至1岁组23.9~54.3,～3岁组26.4~50.6,～6岁组22.8~45.8,～12岁组18.9~41.2,～18岁组男15.7~36.8、女14.2~33.7;ALP(U·L^-1):3月龄至12岁130.0~318.5,～18岁组男124.2~416.1、女79.9~320.3;GGT(U·L^-1):3月龄至1岁组10.0~30.0,～12岁组9.3~21.3,～18岁组男9.6~28.7、女9.5~26.2;LDH(g·L^-1):3月龄至3岁组165.9~266.0,～6岁组155.3~256.2,～12岁组142.9~240.9,～18岁组男134.3~225.3、女111.3~207.0。结论 重庆地区3月龄至18岁健康儿童不同年龄和性别的肝功能水平存在差异,干化学法建立适应年龄和性别的肝功能指标参考区间对相关疾病的诊疗有重要意义。     

体内表达细菌毒力基因分析

面对复杂的宿主环境，细菌在体内是通过调节表达不同的毒力基因建立并延续其感染过程的。目前已建立起多种方法去分析鉴定体内特异表达的细菌毒力基因。其中体内表达技术的应用力为鉴定细菌毒力基因以及揭示细菌致病机理开辟了有力的途径。本文对此作一综述。     

融合蛋白DnaJ-△A146Ply对小鼠肺炎链球菌脑膜炎感染的保护效果

目的 探究融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply对小鼠肺炎链球菌脑膜炎感染的保护效果。方法 侧脑室法构建模型的免疫保护实验:C57BL/6雌鼠随机分为抗DnaJ-ΔA146Ply血清+Ⅲ型组、WT血清+Ⅲ型组、抗DnaJ-ΔA146Ply血清+Tigr4组、WT血清+Tigr4组,经侧脑室注射血清及肺炎链球菌血清型Ⅲ型和Tigr4,构建被动免疫模型,24 h后计数菌载量、ELISA测定脑匀浆炎症因子情况及脑组织切片HE染色,观察抗DnaJ-ΔA146Ply血清被动免疫保护效果。尾静脉法构建模型的免疫保护实验:C57BL/6雌鼠随机分为DnaJ-ΔA146Ply组和PBS组,经3次皮下免疫后,通过尾静脉注射肺炎链球菌血清型Tigr4构建肺炎链球菌脑膜炎,24 h后进行脑匀浆、心脏血等菌载量计数,观察免疫保护作用。结果 侧脑室法注射抗DnaJ-ΔA146Ply血清并进行肺炎链球菌攻毒后,脑组织中细菌载量明显降低,脑中TNF-α表达量下调,侧脑室及软脑膜炎症细胞浸润情况减轻。小鼠3次皮下免疫DnaJ-ΔA146Ply后抗体效价达到106,在尾静脉法构建的Tigr4脑膜炎小鼠中,免疫组脑组织中细菌载量降低。结论 融合蛋白DnaJ-ΔA146Ply对不同血清型肺炎链球菌导致的小鼠脑膜炎感染具有保护作用,能够降低细菌侵袭和脑组织炎性反应。