毒力蛋白CbpA抗肺炎链球菌侵袭性感染的实验研究

目的：原核表达肺炎链球菌毒力蛋白CbpA,探讨其作为肺炎链球菌候选蛋白疫苗的价值。方法：分离培养TIGE4型肺炎链球菌,获取其染色体DNA,采用基因体外重组的方法将CbpA片段克隆到PET-32（a）原核表达载体内,测序鉴定后,原核表达及纯化CbpA;CbpA蛋白抗原主动和抗体被动免疫BALB/c小鼠,TIGR4型肺炎链球菌攻击,监测其生存时间。结果：获得了原核表达的重组抗原蛋白,Western blot鉴定证实为目的蛋白,镍柱纯化并透析复性可得到纯度达90%以上的重组蛋白。主动和被动免疫BALB/c小鼠后,TIGR4型肺炎链球菌攻击,与未免疫组相比,产生的保护性作用具有统计学意义。结论：CbpA蛋白免疫小鼠后可抵抗肺炎链球菌侵袭性感染,CbpA蛋白可作为肺炎链球菌的候选蛋白疫苗。     

肺炎链球菌体内启动子诱捕文库的构建与初步分析

构建肺炎链球菌体内启动子诱捕文库(promoter-trap library),用于筛选肺炎链球菌体内诱导的基因。以穿梭质粒pEVP3为骨架,将无启动子的galU基因作为体内报告基因定向克隆到pEVP3上,与无启动子的体外报告基因lacZ基因融合,构建用于筛选体内诱导基因的载体pEVP3-galU;再把肺炎链球菌基因组DNA的随机酶切片段(200~500bp)克隆到此载体galU基因上游的Bgl II位点,构建了启动子诱捕文库,并转化肺炎链球菌galU缺陷菌株,获得相应的菌株库。文库大约覆盖基因组全长的5倍,插入率达到90%以上,保持了较高的复杂性。对得到的约450 000个肺炎链球菌转化子进行体内、外初步分析,那些从小鼠体内分离出的细菌,并在X-gal平板上为白色的菌落表明galU报告基因上游含仅在体内表达的启动子,提示所构建的启动子诱捕文库可用于筛选肺炎链球菌的体内诱导基因。     

血管紧张素原、血管紧张素Ⅱ一型受体基因多态性与原发性高血压的相关性研究

目的 :探讨血管紧张素原AGT(M2 3 5T)、血管紧张素Ⅱ一型受体AT1 R(A1166C)基因多态性与中国四川籍人群原发性高血压(EH)的关系。方法 :采用聚合酶链反应 (PCR)及限制性片段长度多态性分析 (RFLP)方法分析人类白细胞染色体DNA中AGT、AT1 R基因多态性。结果 :12 2例EH病例组与 87例正常对照组AGT等位基因频率T、M分别为 :T :0 .82 8vs 0 .661,M :0 .172vs 0 .3 3 9。AT1 R等位基因频率A、C分别为 :A :0 .968vs 0 .989,C :0 .0 3 2vs 0 .0 11。各基因型频率及等位基因频率符合Hardy Weinberg平衡定律。EH病例组AGT基因T等位基因频率和TT型明显高于对照组(χ2 =11.7,P <0 .0 1和 χ2 =15 .6,P <0 .0 1)。结论 :AGT基因多态性与EH密切相关 ;而AT1 R基因多态性与EH无关。     

天然抗菌肽的抗菌试验研究

目的 研究天然抗茵肽的抗茵活性。方法 用损伤诱导使家蝇表达天然抗茵肽，通过sephadex过滤层析技术纯化提取，用平板法和稀释法作抗茵活性试验。结果 家蝇抗茵肽对铜绿色假单胞菌、大肠埃希氏茵、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)均有明显的抗菌活性。大肠杆菌与46μg／ml的抗茵肽提取镕液一起37℃孵育60min后，转种MH平板培养，无大肠杆菌生长。结论 家蝇分泌的天然抗菌肽具有明显的广谱抗茵活性，对阴性杆菌和阳性球菌均有杀伤作用。     

家蝇抗菌肽抗菌活性及抗菌机制的初步研究

目的　研究家蝇抗菌肽的抗菌活性及抗菌机制。方法　用损伤感染的方法诱导家蝇幼虫表达抗菌肽 ,通过 Sephadex过滤层析和 HL PC技术纯化提取 ,用平板法和稀释法作抗菌活性试验 ,并用电子扫描技术研究抗菌肽的抗菌机制。结果　家蝇抗菌肽对铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA)均有明显的抗菌活性。大肠埃希氏菌与 5 0 μg/ml的纯化抗菌肽溶液一起 37℃孵育 6 0 min后 ,大肠埃希氏菌不能存活。经电镜扫描观察发现 ,细菌的细胞膜出现破损和穿孔现象。结论　家蝇抗菌肽具有明显的广谱抗菌活性 ,对阴性杆菌和阳性球菌均有杀伤作用。抗菌肽的抗菌机制是通过破坏细菌的细胞膜而杀伤细菌的     

人附睾蛋白4化学发光定量测定法的建立与评价

目的建立人附睾蛋白4(HE4)的化学发光定量检测方法,并进行方法学评价。方法血清中HE4与包被抗HE4单克隆抗体的微磁珠和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗HE4单克隆抗体反应形成双抗体夹心结构,HRP可催化发光底物液(含鲁米诺-H2O2-增强剂)产生大量光信号,根据光信号的量计算血清中HE4的浓度。依据国家体外诊断试剂性能评价指南性文件和美国临床和实验室标准化协会(CLSI)指南性文件,对本方法进行系统评价。结果建立的方法空白限(LoB)为1.014pmol/L、检测限(LoD)为5.252 pmol/L、定量检测限(LoQ)为10.568 pmol/L;甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)≤400 IU/mL、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)≤1 777μg/L、糖类抗原(carbohydrate antigen,CA)125≤3 500 U/mL、CA19-9≤3 500U/mL对本方法无明显交叉反应;线性范围为20~1 700 pmol/L;在100 000 pmol/L时未出现明显钩状(Hook)效应;批内变异系数(CV)为1.5%~3.6%;日间CV为3.8%~6.4%;回收率为98.36%~99.14%;血红蛋白≤4.8 g/L、胆红素≤1 077.5μmol/L、乳糜微粒≤6 000浊度、生物素≤50μg/L、类风湿因子≤1 000 U/L对测定结果无明显影响;37℃保存7 d后相对偏差为-6.63%~10.23%;建立的方法(Y)与Fujirebio公司的ELISA试剂(X)进行方法学比对,相关曲线为Y=1.023X-12.280,r=0.989 7(P0.01)。结论本研究建立的HE4磁微粒化学发光免疫测定法各项性能符合临床实验室需求,为卵巢癌的辅助诊断提供了有效工具。     

宫颈癌脱落细胞核仁形成区嗜银蛋白定量研究

目的对宫颈癌细胞核仁形成区嗜银蛋白(AgNORs)进行定量研究,探讨脱落细胞AgNORs在宫颈癌诊断中的价值。方法应用银染法结合计算机图像分析软件测定22例正常人,34例宫颈癌宫颈脱落细胞及相应石蜡切片中AgNORs银染面积。结果宫颈癌患者宫颈脱落细胞核仁银染面积与细胞核面积的比值(I/S%)为9.64±1.22%,与正常对照组比较具有显著性差异(P<0.05),与石蜡切片染色结果一致(10.12±1.65%)。结论宫颈脱落细胞AgNORs与细胞增殖活性有关,对宫颈癌的诊断有一定的临床应用价值。     

035 介绍一种评价肾小管损伤的技术:ELISA法测定尿海藻糖酶

肾近曲小管的α 海藻糖酶是一种水解海藻糖为两分子葡萄糖的糖蛋白 ,它可反映肾近曲小管损伤状况 ,然而由于测定酶的活性相当复杂 ,并且在尿液标本中酶部分灭活导致传统方法的酶活性不能完全反映出全部海藻糖酶蛋白的量 ,因此目前它的活性测定尚不十分普及。作者介绍了一种ＥＬＩＳＡ法测定尿海藻糖酶。方法　用人类海藻糖酶单克隆抗体建立了一种测定尿海藻糖酶的“三明治”ＥＬＩＳＡ法 ,同时测定尿海藻糖酶蛋白浓度和尿海藻糖酶活性并比较它们之间的结果。结果　此法较测定酶活性灵敏 ,能检测出肾脏疾病海藻糖酶的微小变化。批内和批间Ｃ…     

脉冲电场凝胶电泳及其应用

脉冲电场凝胶电泳 (pulse field gel electrophoresis,PFGE)是用于分离大分子量线状 DNA分子的一种电泳方法 ,其分析原理为根据不同大小的 DNA片段在一定大小孔径的琼脂糖凝胶中 ,由于电场的不断变化而改变其泳动方向的时间不同而将其分离。 PFGE的发展过程中有三个值得注意的改进 ,即电场倒转凝胶电泳 (PIGE)、偏转正弦场凝胶电脉 (BSFGE)和正交变场凝胶电泳 (OFAGE) ,各有其独特的优点和用途。 PFGE现主要应用于染色体 DNA的分析 ,如从环状 DNA中分离线状DNA、分离 EB病毒基因组、研究细胞凋亡及电泳核型分析等 ,尤其是细胞凋亡的研究 ,将为阐明肿瘤的机理及治疗提供崭新的途径     

荧光定量PCR检测HCV-RNA的研究进展

荧光定量PCR(FQ-PCR)是近几年来发展起来的可用于检测丙型肝炎病毒(HCV)感染的一种新手段。现介绍目前常用的荧光定量PCR技术,并通过与常规定性PCR和ELISA法的比较阐明该技术对HCV进行定量检测的临床价值。