多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

利用定点突变技术构建突变nm23-H1和EGFP融合基因

背景与目的以前的研究已经证明nm23-H1基因是肿瘤转移抑制基因，但其抑制肿瘤转移的分子机制目前还不完全清楚。基因定点突变技术可以精确地改变基因的特定碱基序列，获得突变蛋白质。本研究的目的是应用基因定点突变技术构建突变型nm23-H1-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因，为进一步研究肿瘤抑制基因nm23-H1的功能、生化作用机制提供理论基础和实验依据。方法以逆转录病毒PLXSN-野生型nm23-H1-EGFP质粒为突变模板，应用QuikChange^TM定点突变方法，简单、快速、高效地引入nm23-H1^S44A、nm23-H1^P96S、nm23-H1^H118F、nm23-H1^S120G四个点突变和一个联合位点突变nm23-H1^P96S-S120G，构建了突变型nm23-H1-EGFP融合基因。结果成功构建了nm23-H1^S44A-EGFP、nm23-H1^P96S-EGFP、nm23-H1^H118F-EGFP、rim23-H1^S120G-EGFP、nm23-H1^P96S-S120G-EGFP五个突变型nm23-H1-EGFP融合基因，经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致。结论成功构建了五个具有不同突变位点的突变型nm23-H1-EGFP融合基因。QuikChange^TM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。     

肺癌组织中Endostatin mRNA转录表达与血清Endostatin水平关系的相关性研究

目的探讨非小细胞肺癌患者肺癌组织中Endostatin mRNA转录表达水平与血清中内皮抑素(Endostatin)水平的关系以及两者水平与肺癌临床病理生理特征的关系.方法用ELISA法检测46例非小细胞肺癌患者血清中Endostatin的水平;用RT-PCR法检测其肺癌组织中Endostatin mRNA的转录表达水平.结果1)肺癌患者血清中Endostatin水平为20.85±4.56ng/ml;肺癌组织中Endostatin mRNA的转录表达产物的OD比值为0.872±0.071.2)肺癌患者血清中Endostatin水平及肺癌组织中Endostatin mRNA的转录表达水平均与肺癌原发肿瘤大小、有无远处转移、细胞分化程度和P-TNM分期等有密切关系(P＜0.05),而与肺癌原发部位、淋巴结转移状态、组织学类型,患者性别、年龄和吸烟与否等均无明显关系(P＞0.05).3)肺癌组织中CollagenⅩⅧ/Endostatin mRNA的转录表达与血清中Endostatin水平呈非常显著正相关(r=0.686,P＜0.01).结论肺癌患者肺癌组织中Endostatin mRNA的转录表达与血清Endostatin水平有非常显著正相关关系,且均与肺癌的发生、发展、远处转移和细胞分化不良有密切关系,非小细胞肺癌患者血清中Endostatin水平和肺癌组织中Endostatin mRNA的转录表达水平可能是预测肺癌恶性行为的有用指标.     

肺癌患者淋巴结微转移MUC1表达的探讨

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者淋巴结微转移MUC1表达用于分子诊断特异性和敏感性及临床意义.方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,对31例肺癌患者119枚和10例肺良性病变患者35枚淋巴结MUC1 mRNA表达进行检测.结果:巢式RT-PCR技术的敏感性达10-6.RT-PCR检测的119枚肺癌患者淋巴结中65枚存在MUC1 mRNA表达,阳性率为54.6%(65/119);病理学方法检测出41枚淋巴结存在癌转移,阳性率为34.5%(41/119).肺良性病变患者35枚淋巴结中MUC1 mRNA表达均为阴性.淋巴结微转移与肺癌组织学类型、细胞分化程度及pTNM分期均存在密切关系(P＜0.05).结论:RT-PCR是一种特异性、敏感性均较高的肿瘤微转移检测方法,MUC1 mRNA可能是检测肺癌微转移的一个有价值的指标,为制定治疗方案和评估预后提供重要的参考依据.     

限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究

目的 建立甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法,研究原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态.方法 针对P16基因启动子区富含CpG的序列,设计3条引物,进行半巢式降落PCR扩增,检测原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态;并将P16基因启动子区340 bp片段克隆到pMD18-T载体,E.coli JM109扩增此质粒后经CpG甲基化酶M.Sss Ⅰ处理,再用Hpa Ⅱ酶切验证获得P16基因启动子区甲基化阳性的质粒P16Pm 并进行特异性和灵敏度实验.以此甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法检测40例人原发性肝癌和3例正常人肝组织DNA样品的P16基因启动子区甲基化状态.结果 所采用的Hpa Ⅱ酶切后半巢式PCR方法的特异性强,灵敏度达100 fg;对40例人原发性肝癌组织DNA样品P16基因的启动子区甲基化状态检测显示甲基化阳性率为30%(12/40),3例正常人肝组织均为阴性(0/3).结论 P16抑癌基因启动子区甲基化可能与肝癌发生发展有关.本实验方法简便、成本低廉,并有高度的特异性与灵敏度,在大规模检查中有实际应用价值.     

人原发性肺癌癌组织p53、Rb基因突变研究

人原发性肺癌癌组织ｐ５３、Ｒｂ基因突变研究周清华，刘伦旭，杨振华，王国丽，孙芝琳肺癌作为人类最常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展均涉及环境和遗传因素的改变。而环境和遗传因素的改变，最终将导致原癌基因的激活和抑癌基因的失活。ｐ５３基因作为一种主要的抑癌基...     

Smad3D和Smad7重组腺病毒载体的快速构建

目的 简化重组腺病毒载体的构造方法，构建含Smad3DcDNA或Smad7cDNA的重组腺病毒载体，为下一步的基因治疗奠定基础。方法 以AdEasy System为基础，应用序贯化学转化方法，在大肠杆菌E．coli BJ5183体内将携带目的基因的穿梭质粒和骨架质粒重组。结果 成功构建了重组腺病毒载体pAd-Smad3D和pAd-Smad7及空腺病毒载体，并经酶切鉴定证实。结论 用序贯化学转化方法，可以快速高效地在大肠杆菌内构建重组腺病毒载体。     

Northern blot analysis of nm23 gene expression in human lung cancer

Thenm23genewas0riginallyidentifiedbySteegandc0lleagues"'attheNationalCancerInstitute(USA)inl988.Twois0typesofnm23geneinhuman,knownasnm23-H,andnm23-H,l']havebeendescribed,whicharebothlocatedonchrom0some17q2l.3andencodef0rnucleosidediph0sphatekinase(NDPK).l']Theearystudiesoncancercelllinesrevealedthatnm23genecouldsuppressthemotilityandmetastaticpotentialofcancercells,andwasproposedtobeametastasissuppressorgene.More0ver,theass0ciationofreducednm23expressionwithhighmetastahcpotentialhasalsobe…