牛气管抗菌肽cDNA的克隆与表达

目的：开发一种有效抑制动物细菌感染的重组抗菌肽。方法：根据已发表的牛气管抗菌肽（bTAP）mRNA序列设计引物，用RT—PCR从奶牛气管上皮细胞总RNA中扩增出214bp的bTAPcDNA，将其克隆入pUCm—T载体进行序列测定，将此cDNA分别克隆入真核表达载体pcDNA3和原核表达载体pGEX-6p-1进行表达研究。结果：测序结果与已发表的bTAP序列有3个碱基差异，其中2个导致氨基酸替换；经微球菌溶解试验证明，注射在小鼠皮下的重组质粒pcDNA—tap能表达有活性的bTAP；抗体测定结果显示重组质粒pcDNA—tap经5次免疫后家兔产生的抗bTAP抗体效价达1：800；经IPTG诱导后，含重组质粒pGEX—tap大肠杆菌能表达预计大小的GST—bTAP融合蛋白，且能被兔抗bTAP识别。结论：本研究克隆的bTAPcDNA可用于表达研究及相关基因工程产品的开发。     

小鼠酪氨酸羟化酶启动子序列分析

目的 对小鼠酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydroxylase,TH) 启动子进行序列分析,研究启动子不同区域对下游基因表达调控能力.方法 高保真PCR分别扩增出450、1500、2000、2400、3400 bp TH启动子片段置换pcDNA3中CMV启动子,并在多克隆位点插入EGFP报告基因,重组后质粒分别瞬时转染MN-9D细胞 (TH+) 和ECV细胞 (TH-),流式细胞仪观察EGFP基因在细胞内表达情况.结果 转染后MN-9D细胞中EGFP阳性率分别为8.01%、7.97%、7.85%、7.72%、7.74%,差异无显著性.转染ECV细胞 (TH-)中,EGFP阳性率分别为6.51%、6.35%、6.71%、0.89%、1.02%.3400bp、2400 bp启动子片段在TH-细胞中调控能力受到明显抑制.结论 上述启动子片段均有调控基因表达能力,初步证明TH启动子中特异性调控区域在2400～2000 bp范围内.     

巨噬细胞特异的人工miRNA表达载体的构建与鉴定

根据小RNA(microRNA,miRNA)前体分子结构特点而设计并合成的人工miRNA(artificial miRNA,amiRNA)也可以在体内通过与内源miRNA相同或相似的途径发挥RNA干扰(RNA interference,RNAi)作用,目前amiRNA技术在调控基因表达、抗病毒领域得到了广泛应用[1-4]。amiRNA由表达载体生成,弥补了人工合成小干扰RNA(small interfering RNA     

SV40 T基因转化的山羊乳腺上皮细胞系及其生物学特性

为建立血栓闭塞性脉管炎(Thromboangitis obliterans TAO)的大鼠模型，采用烟草致敏、寒冻、注射TAO免疫提取物、影响激素水平等方法进行复制。通过体征观察、常规病理、扫描电镜观察、血液流变学等检查，并与已确诊的人类TAO比较，可基本确认研制结果符合血栓闭塞性脉管炎动物模型。同时对各种致病因素以及对模型复制的影响因素进行了较为客观的探讨。     

小鼠酪氨酸羟化酶启动子克隆

为了克隆小鼠酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)启动子,并对其特异性调控能力进行研究,本实验采用重叠延伸PCR高保真扩增出小鼠TH启动子片段,测序正确后,重组构建质粒,并用TH启动子调控EGFP基因的表达。然后分别转染MN-9D细胞(TH+)和ECV细胞(TH-),观察EGFP基因在细胞内表达情况。结果显示:扩增出小鼠TH启动子序列与GenBank报道一致;单酶切和质粒PCR鉴定证实小鼠TH启动子和EGFP基因已经克隆入重组质粒中;小鼠TH启动子能调控EGFP在MN-9D细胞中表达,不能调控EGFP在ECV细胞内表达。初步确定克隆的小鼠TH启动子具有特异性调控目的基因表达的能力。     

乳腺高效表达人溶菌酶转基因小鼠的制备

目的　研究自行构建的动物乳腺特异表达载体p2 0 5C3的表达特性。方法　将人溶菌酶 (hLYZ)cDNA插入p2 0 5C3载体 ,用获得的基因构件注射小鼠受精卵 ,用PCR和Southernblot对出生鼠进行基因整合检测 ,用微球菌溶解试验和Westernblot对表达产物进行鉴定。结果　共出生 136只F0 代小鼠 ,从中筛选出 4只 (1♀ 3♂ )转基因整合阳性鼠 ,其中的 1只母鼠不表达hLYZ ,1只雄鼠的 4只F1 代母鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为 5、75、175和 2 0 0 μg ml,纯合后的 3只F3代母鼠乳汁中hLYZ的表达量分别为 5 2 6 μg ml、6 4 8μg ml和 75 0 μg ml,表达仅限于乳腺中 ,表达产物的相对分子质量与正常hLYZ相同。结论　p2 0 5C3能驱动hLYZcDNA在小鼠乳腺中特异和高效表达 ,可以用于动物乳腺生物反应器的研制。     

巨噬细胞特异的人工miRNA表达载体的构建与鉴定北大核心CSCD

根据小RNA（microRNA,miRNA）前体分子结构特点而设计并合成的人工miRNA（artificial miRNA,amiRNA）也可以在体内通过与内源miRNA相同或相似的途径发挥RNA干扰（RNA interference,RNAi）作用,目前amiRNA技术在调控基因表达、抗病毒领域得到了广泛应用[1-4]。     

金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的克隆和序列测定

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列，设计并合成一对特异性的引物。以鼠金黄色葡萄球菌临床分离株SA.m0109的基因组DNA为模板，利用PCR技术对其耐热核酸酶nuc基因片段进行扩增，获得了预计大小的片段。将这一片段克隆到质粒载体pGEM-T中，对重组质粒pGEM-NUC进行限制内切酶分析，PCR鉴定和克隆片段的序列测定。证实了克隆片段的可靠性。     

两种含SV40T不同区段的基因构建及其转基因小鼠的建立

目的　为解决SV4 0T转基因小鼠高发瘤难保种的问题 ,构建了两种含有SV4 0T不同区段的外源基因 :Rb结合域点突变的SV4 0T基因 (SV4 0T DRb)和无p5 3结合域的SV4 0T基因 (SV4 0T Dp5 3)。方法　利用分子生物学的基因克隆手段 ,将改造的SV4 0T基因片段克隆测序 ,最终将这两个改造后的基因克隆进乳腺特异性的真核表达载体p2 0 5C3中 ,运用雄原核显微注射法制备转基因小鼠。结果　利用PCR方法检测出 6只双阳性转基因 (同时检测到SV4 0T DRb和SV4 0T Dp5 3两种基因 )小鼠 ,为避免检测结果中假阳性的发生 ,应用Southern blot方法检测出 1只双阳性转基因小鼠。结论　本试验的结果证明 ,构建的两种含SV4 0T不同区段的策略是成功的 ,其建立的阳性转基因小鼠确实是弱化了SV4 0T转基因小鼠高发瘤的特性。     

金黄色葡萄球菌对小鼠致病性的实验研究

目的：通过金黄色葡萄球菌对小鼠致病性的实验研究，探讨该菌的致病机理。方法：用金黄色葡萄球菌标准株(SAl800)和鼠源性分离株(SA．m0109)攻击小鼠，造成小鼠金黄色葡萄球菌感染模型，观察其病变特点，并进行检测，确定感染率与毒力。结果：SAl800和SA．m0109均能造成小鼠发病，其中SA．m109致病性较强。SAl800对小鼠的半数致死量(LD50)为10^—4．1／0．2m1；SA．m0109对小鼠的半数致死量(LD50)为10^—5．1／0．2m1。结论:为金黄色葡萄球菌的致病机理和疫苗研究提供了良好的动物模型。