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背景:RNA干扰技术的应用,关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞,目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。
目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。
设计、时间及地点:开放性实验,于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。
材料:穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品;AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.(Canada)公司产品。
方法:选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列,设计合成为相应的双链DNA,并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接,构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒。
主要观察指标:对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。
结果:构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析,证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功,测定滴度为1.4×109 nfu/L。
结论:实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。 相似文献