凝血酶敏感蛋白-1介导脓毒症肝损伤中ERK通路的作用研究

目的观察凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)介导的脓毒症肝损伤中细胞外调节激酶(ERK)通路的作用.方法选用雄性Balb/c小鼠随机分为4组(n=5):假手术(sham)组、CLP对照组、阴性片段对照组、有效片段组.利用流体尾静脉注射法予以TSP-1特异性的siRNA片段进行RNA干扰(RNA)i,下调肝脏TSP-1表达,采用盲肠结扎穿刺(CLP)制作脓毒症模型,检测肝脏TSP-1表达变化,检测血清转氨酶和TNF-α含量,检测肝脏ERK蛋白表达变化.结果有效片段组中肝脏TSP-1的表达明显下调,验证RNAi有效.与假手术组相比,CLP组和阴性对照组转氨酶ALT和AST含量、TNF-α含量明显升高(P<0.05),磷酸化ERK蛋白表达明显降低(P<0.05),予以有效片段进行RNAi后,ALT和AST含量、TNF-α含量明显降低(P<0.05),磷酸化ERK蛋白表达明显升高(P<0.05).结论 TSP-1参与介导脓毒症肝损伤,导致血清转氨酶及TNF-α含量升高,ERK通路的抑制是其分子机制之一.     

应用免疫磁珠负选法分离与纯化小鼠骨髓间充质干细胞

目的：拟建立体外分离纯化小鼠骨髓间充质干细胞的新方法，从而得到高纯度的骨髓间充质干细胞。 方法：实验于2002—09／2005-03在解放军第二军医大学附属长海医院烧伤科实验室完成。①选取清洁级7d龄FVB／N小鼠15只，利用免疫磁珠法（CD11b负选）从小鼠的骨髓细胞中分离纯化骨髓间充质干细胞：颈椎脱臼处死后无菌条件下取出小鼠双侧股骨，消毒离断后去除上清及脂肪层，吹打成单细胞悬液后接种于培养基中。贴壁细胞达到90％左右融合后，用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸进行消化，将悬浮的细胞与CD11b抗体避光反应2min。移入已预置入磁场的LD管，不加压通过，收集管中的细胞成分，用培养基重悬并吹打成单细胞悬液后以1×10^9L^-1-2×10^9L^-1的密度接种于培养基中培养。②培养传代后流式细胞仪检测细胞周期、表面标记物，并利用诱导剂观察其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞的能力。 结果：①细胞形态学观察：免疫磁珠法获得的细胞几乎无圆形细胞夹杂。贴壁率高。形态单一呈典型成纤维样、漩涡状生长。体外增殖迅速。②细胞生长曲线绘制情况：细胞贴壁后一两天为细胞生长缓滞期，之后进入对数增长期，六七天后进入平台期。③细胞周期分析结果：G0／G1期细胞约86％，S＋G2＋M期约14％。④细胞袭面标记物检测结果：第3代骨髓间充质干细胞3％表达CD45，68．7％表达CD29，3％表达CD34，89．6％表达CD105。⑤骨髓间充质干细胞向脂肪细胞与成骨细胞定向分化情况：在地塞米松、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、吲哚美辛等诱导剂作用下，脂肪细胞＋成骨细胞诱导组细胞第5天开始油红O染色显示细胞核呈蓝色，细胞内脂滴呈橙色；在β-甘油磷酸钠、2-磷酸-抗坏血酸等诱导剂的作用下，第10天开始AKP染色显示细胞内有致密颗粒形成，Von Kossa染色显?