大鼠TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体的构建及其对HSC-T6细胞TIMP1表达影响的研究

目的构建大鼠TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体，并观察其转染HSC-T6细胞后对TIMP1基因表达的影响。方法根据BLOCK-iT Poll miR RNAi Expression System with EmGFP要求，应用在线miRNA设计工具http：//maidesigner．invitrogen．com／maiexpress／，针对大鼠TIMP1基因（GenBank：U06179）的598位点设计、合成Oligo DNA，退火形成双链DNA后，与载体pcDNA TM^6．2-GW／EmGFP-miR连接，转化Top10感受态细胞，构建TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体。经PCR扩增及测序鉴定正确后，以脂质体Lipofectimine TM^2000介导转染经TGF-β1刺激的大鼠肝星状细胞株HSC-T6，24、48、72h后收集细胞，应用RT-PCR鉴定TIMP1的表达情况。结果经PCR及测序鉴定构建的TIMP1 miRNA慢病毒RNAi载体正确；将其转染经TGF-β1刺激的大鼠肝星状细胞株HSC-T6，48h即可见TIMP1 mRNA表达量下降，72h检测不到TIMP1 mRNA的表达，而未转染组及转染pLacZ-miR／GFP（阴性对照）组未见此改变。结论成功构建大鼠TIMP1 miR—NA慢病毒RNAi载体pTIMP1-miR／GFP；pTIMP1-miR／GFP使大鼠肝星状细胞株HSC-T6TIMP1基因沉默。提示了RNA干扰可使肝纤维化形成过程中的关键因子TIMP1基因沉默，为RNA干扰技术进一步应用治疗大鼠肝纤维化模型奠定了基础。     

基因芯片技术在乙型肝炎病毒分型和耐药突变检测中的应用

目的通过基因芯片检测系统，快速检测临床样品中乙型肝炎病毒的基因亚型和耐药突变情况。方法用基因芯片法检测352例临床样品，对慢性乙型肝炎患者感染的HBV亚型及耐药情况进行分析。结果在352例临床病例中，共检出耐药突变病例124例，检出率为35．7％。发现3种基因亚型，其中B型222例，占63．8％；C型115例，占33．0％；D型1例，占0．3％；B、C混合感染9例，占2．6％；型别未分1例，占0．3％。结论PCR与膜芯片杂交技术可检测乙型肝炎病毒基因亚型及耐药突变类型，并具有快速、高通量、敏感的特点，适合各临床医院开展应用。     

CD59在艾滋病感染者CD4^＋T细胞表达及凋亡的影响

目的探讨补体调节蛋白CD59在艾滋病（HIV）感染者外周血CD4^＋T细胞上的表达及与凋亡之间的关系。方法收集12例确诊HIV感染者外周血标本（观察组）,同时收集10例健康对照者外周血标本（对照组）。分离外周血单个核细胞（PBMC）,并进行细胞表面染色。使用BDFACSCanto流式仪检测各项指标,采用FACSDiva软件分析CD4^＋T细胞CD59的表达情况,并分析CD59^＋CD4^＋T、CD59^-CD4^＋T细胞的凋亡情况。结果观察组CD4^＋T细胞CD59表达明显高于对照组（t=5．198,P〈0．01）;CD59＋CD4^＋细胞凋亡比率明显升高（t=5．968,P〈0．01）;而CD59^-CD4^＋T细胞的凋亡比例二组间差异无统计学意义（t=0．1353,P=0．8577）。结论HIV感染可引起CD4^＋T细胞补体调节蛋白CD59的表达,而CD59的表达会使CD4^＋T细胞凋亡增加。     

涂阳活动性肺结核患者HRCT评分与细菌学及免疫学相关性分析

目的探讨HRCT评分标准在诊断活动性肺结核中的应用价值。方法对42例痰涂阳性肺结核患者,进行HRCT检查和评分,每侧肺组织划分为为三个区域,分别对各类型CT征象所累及范围进行评分;分析评分结果与痰细菌学检查结果和外周血结核菌特异性IFN—y水平之间的相关性。结果根据结核菌涂片结果分为4组,其中,AFB（＋）12例、AFB（＋＋）11例、AFB（＋＋＋）10例、AFB（＋＋＋＋）9例,相关性分析显示（1）HRCT总评分与痰阳性分级有正相关性（r=0．9661 P〈0．0001）：（2）HRCT总评分与结核菌抗原ESAT6、P4-6、P8．10特异性IFN—y释放水平均呈正相关（r=0．4805,P=0．0017,r=0．4451,P=0．0083,r=0．4211,P=0．0131）。结论以活动性肺结核患者复杂的CT征象的范围为基础的HRCT评分标准与细菌学及免疫学均呈正相关,表明该HRCT评分标准对临床诊断治疗和疗效判定具有一定指导意义。     

h5n1禽流感假病毒体外中和试验技术平台的建立与应用

目的 建立h5n1禽流感假病毒的体外中和试验技术平台,并系统评价2份h5n1人禽流感患者恢复期血清的中和效价.方法 通过磷酸钙沉淀法将转移载体phr-luc、包装载体pcmv△8.2和包膜载体cmv/r-sz(或cmv/r-th)共转染人胚肾细胞(293t),72 h后收集假病毒上清液,免疫印迹(western blot)鉴定假病毒颗粒ha、p24蛋白的表达,并取200μl假病毒上清液测定感染活性.收集制备假病毒过程中整合ha蛋白的293t细胞,通过流式细胞术测定2份恢复期血清中的ha抗体.利用2份恢复期血清分别与深圳株和泰国株假病毒进行中和试验,通过计算ic5o判断不同血清对2株假病毒中和效价的差异.结果 构建的2株假病毒颗粒不仅含有hiv基质蛋白p24,还可以整合ha蛋白,并且能够由前体蛋白ha0裂解为具有生物活性的ha1和ha2.200μl假病毒上清液感染靶细胞后rla值约为2×104,具有较高的感染效价.facs检测结果显示2份血清中均含有ha抗体,而且对不同分枝的假病毒具有交叉反应性.中和试验表明2份血清对深圳株和泰国株假病毒均具有中和能力,而且对不同分枝的假病毒具有交叉中和活性,但对深圳株的中和效价均高于泰国株.结论 本研究成功构建具有感染活性的深圳株和泰国株h5n1禽流感假病毒,并可以快速、安全、高效的评价血清的中和效价,具有广阔的应用前景. abstract： objective to establish neutralization assay based on h5n1 avian influenza pseudotyped virus in vitro and to evaluate neutralizing titer of convalescent serum from 2 patients with h5n1 avian influenza.methods phr-luc,pcmv△8.2 and cmv/r-sh or cmv/r-th were cotransfected into 293t cell by co-precipitation with calcium phosphate.pseudotyped virus supernatant was harvested 72 h posttranofection and identified the expression of ha and p24 by western blot,and then we analyzed infective activity of 200 μl supernatant of pseudotyped virus.293t cell integrated ha was prepared and anti-ha antibodies in convalescent serum were measured with facs assay.neutralizing titers of convalescent serums against shenzhen and thailand pseudotyped virus were determined based on calculating ic50 with neutralizing assay.results pseudotyped virus involved p24 and ha,and precursor protein ha0 could cleavage into ha1 and ha2 with biological activity.pseudotyped virus possessed better infective activity,and rla value was about 2 × 104 with 200 μl supernatant.both convalescent serums contained anti-ha antibodies and had cross-reactivity against different virus clades with facs assay.both convalescent serums had neutralizingactivity and could cross-neutralize different virus clades.however,both serums'neutralizing titers against shenzhen virus were higher than thailand.conclusion we successfully constructed infectious pseudotyped virus which integrated ha of shenzhen or thailand virus,and it could be used for evaluation of serum neutralizing activity fast,efficiently and safely with broadly application prospect.     

美国旧金山首批500例AIDS患者的存活情况

从1980年至1984年5月,美国旧金山505名居民被诊断为 AIDS,其中99%是同性恋或两性恋男性,仅2例为女性.白人占92%,黑人与西班牙人各占4%。确诊时年龄21～65岁,平均35岁。到1985年底已有420例(83%)病人死亡,74例(15%)仍活着,11例(2%)失访。估计病人平均存活时间为11个月。1年与3年存活率分别为44%和11%。首次确诊时有一种机会性感染(OI)的病人其存活时间比单纯卡波济肉瘤(KS)患者要短(P<0.0001),而患者有卡氏肺     

HBV相关性IgA肾病研究近况

IgA肾病(IgAN)于1968年由Berger首先报告,其主要特点是在肾小球系膜区有以IgA为主的免疫球蛋白沉积。IgAN的病因目前尚未明了,近年来一些研究资料表明HBV感染可引起IgAN(HBV相关性IgAN,HBV-IgAN),在HBV流行区可能有相当一部分IgAN是由HBV所致,因此HBV-IgAN的重要性亦日益引人注目。本文就HBV-IgAN研究近况综述如下。     

SLC7A11基因表达沉默的肝癌细胞株的构建及筛选

目的:构建并筛选出SLC7A11基因表达沉默的肝癌LM3细胞株,为研究SLC7A11基因的表达沉默对肝癌发生发展的影响奠定基础。方法:针对SLC7A11基因的不同部位合成3个siRNA的寡核苷酸片段,分别将其克隆到真核表达载体p GPU6/GFP/Neo中。利用脂质体转染法分别将质粒导入肝癌LM3细胞,24小时后观察细胞内GFP表达情况,并通过real-time PCR及Western blot的方法比较各组细胞SLC7A11基因mRNA和蛋白的表达水平,然后用G418对转染细胞进行筛选培养。结果:经酶切分析及测序验证,成功构建了靶向沉默SLC7A11基因的真核表达质粒p GPU6-SLC7A11-siRNA;通过real-time PCR及Western blot的方法验证,成功筛选出SLC7A11基因表达沉默的肝癌LM3细胞株。结论:成功构建并筛选出SLC7A11基因表达沉默的肝癌细胞株,为进一步研究SLC7A11基因表达沉默对肝癌细胞发生发展的影响奠定了基础。     

HIV-HCV合并感染者血清HCV RNA的定量检测

人类免疫缺陷病毒(HIV)与丙型肝炎病毒(HCV)传播途径相同，二者可以合并感染。据报道，在美国和欧洲有约30％的HIV感染者合并有HCV感染，而在吸毒人群中HIV—HCV的合并感染率高达60％～90％。国外研究显示，HIV感染会对HCV的病程造成影响，加快肝硬化的进程提前进入肝功能衰竭；而HCV又会加速HIV引起的CD4细胞破坏，促进HIV复制，使HIV进展到艾滋病(AIDS)相关疾病及死亡的时间缩短。目前，国内对HIV—HCV合并感染的研究报道较少。为了探索国人HIV—HCV合并感染对两种疾病的相互影响，     

DC-SIGNR基因绞链区重复序列多态性检测方法的建立与应用

目的建立树突状细胞表面的蛋白质DC-SIGNR基因绞链区重复序列多态性的检测方法，了解宿主因素在抗艾滋病病毒1型（HIV-1）所起的作用。方法设计特定引物，用PCR方法对DC-SIGNR基因绞链区重复序列进行扩增，用凝胶电泳法对其产物进行分析。结果根据DC-SIGNR绞链区重复序列的数量，DC-SIGNR绞链区重复序列具有高度基因多态性，而DC-SIGN则罕见基因多态性。结论所建立的检测DC-SIGNR绞链区重复序列的方法简单，易于掌握。由于DC-SIGNR重复序列数量的改变可能会影响其正常功能，从而影响宿主与HIV-1的结合能力，因此该法为研究宿主因素在抗HIV-1感染中所起作用的一种好方法。