联合分析HCV种属信息区和高度保守区序列确定广东地区HCV基因型和亚型

目的扩增HCV种属信息区NS5B和高度保守区5-UTR基因序列,用系统进化树法深入分析HCV基因型和亚型,阐明广东地区丙型肝炎患者HCV基因型和基因亚型的特点。方法采集99例慢性丙型肝炎病例血清,应用RT-PCR技术分别扩增HCVNS5B区和5-UTR特定片段,测序后进行系统进化树分析,确定HCV基因型及亚型。结果99例患者标本均准确分型,其中NS5B区段分型74例,5-UTR区段分型99例。HCV基因型和亚型的分布:1a亚型1例、1b亚型59例、1型7例、2a亚型11例、3a亚型3例、3b亚型2例、3型3例、6a亚型13例;另有2例标本在两区段分型不同,5-UTR/NS5B区段分型分别为6a/1b和3a/1b。两区段共同分型74例,72例标本在两区段基因型一致,2例标本在两区段基因型不同,为HCV重组体。结论联合分析HCV不同区段基因序列,可提高HCV基因分型的准确度及灵敏性。广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主;其次为6a和2a;3型中的a、b亚型也占有一定比例。     

降钙素原的克隆、表达及鉴定

目的：合成降钙素原的全长基因,表达出降钙素原的融合蛋白并对其鉴定,为PCT的功能研究及单抗制备提供有力的实验基础。 方法 采用多引物人工一步合成基因技术合成降钙素原的全长基因,克隆至原核表达载体PET-20B表达出重组蛋白,将此初步表达的蛋白进行Western blot鉴定。 结果 成功表达降钙素原重组蛋白,Western blot 成功鉴定。 结论 成功表达降钙素原重组蛋白并成功鉴定,为明确降钙素原来源和病理生理作用的研究奠定了基础, 以及为制备其单克隆抗体提供实验材料。     

人WFDC2启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其在卵巢癌HO8910细胞中的活性鉴定

目的:构建WFDC2启动子荧光素酶报告基因重组质粒PGL3-WFDC2-Promoter,并进行功能鉴定。方法:通过PCR的方法,从HO8910细胞基因组DNA中获得WFDC2基因编码序列上游的WFDC2启动子序列;软件分析WFDC2启动子的结构,选取调控密集区域,克隆到报告基因pGL3载体上,构建WFDC2启动子的报告基因载体;用脂质体转染法将2个报告基因载体分别转染至卵巢癌HO8910细胞系;采用双荧光素酶报告基因系统评估WFDC2启动子活性。结果:PCR方法成功钓取WFDC2启动子片段,测定其编码序列及读框正确,酶切鉴定亚克隆序列正确,瞬时转染HO8910后经报告基因检测,两段启动子均具有转录活性。结论:成功构建了WFDC2启动子的报告基因载体,为进一步研究WFDC2启动子和卵巢癌的关系奠定了实验基础。     

时间分辨免疫荧光法定量检测甲胎蛋白(AFP)试剂的性能研究

目的 在成功建立时间分辨免疫荧光法定量检测甲胎蛋白（AFP）反应模式并确定该检测试剂盒的生产工艺后,对该试剂盒的产品性能进行测定和评估.方法 按试剂盒操作说明书对试剂盒的准确度、精密度、剂量-反应曲线、最低检测量、稳定性、特异性等指标进行测定.结果 试剂盒准确度好,其线性检测范围为1～1000 IU/ml,最低检测量为0.11 IU/ml,分析内精密度〈5%,分析间精密度〈10%.CEA（1000 ng/ml）、CA125（600 IU/ml）、CA15-3（500 IU/ml）、CA19-9（500 IU/ml）及白蛋白（1000 ng/ml）与本试剂盒AFP的交叉反应值分别为0.35、0.28、0.25、0.31、0.42 IU/ml.结论 试剂盒各项性能指标均达到相关检定要求,满足临床检测的需要.     

双标记AFP及Free-β-HCG时间分辨荧光免疫分析法的建立

目的：研制能同时检测人血清AFP和Free-β-HCG的双标记时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）试剂盒。方法：铕（Eu3＋）标记抗AFP单克隆抗体,用钐（Sm3＋）标记抗Free-β-HCG单克隆抗体,采用双抗体夹心法建立AFP/Free-β-HCG双标记TrFIA试剂,对试剂的各项性能指标进行评价。结果：AFP分析灵敏度为0.1U/ml,分析内和分析间的精密度分别为1.2%～5.9%和2.8%～6.3%,检测试剂的测量范围为（0.1～500）U/ml;Free-β-HCG分析灵敏度为0.25ng/ml,分析内和分析间的精密度分别为1.5%～6.2%和3.5%～5.6%,检测试剂的测量范围为（0.25～200）ng/ml。孕妇血样用本试剂盒与进口的同类试剂盒同时检测,AFP和Free-β-HCG的相关系数分别为0.987、0.968,具有较好的一致性。结论：自制AFP/Free-β-HCG双标记TrFIA试剂盒的各项性能指标均能达到临床检测要求,可替代国外同类产品。     

超敏C-反应蛋白时间分辨荧光免疫分析法的建立

目的:血清超敏C-反应蛋白(CRP)时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)法的建立. 方法: 采用双抗体夹心法检测血清CRP水平(1株抗CRP的单抗用于包被微孔板,另1株抗CRP的单抗用于Eu3 标记). 结果: TRFIA的线性测量范围为1～1000 mg/L,灵敏度为0.06 mg/L,批内和批间精密度分别为4.0%～7.2%,6.7%～10.8%. 与人IgG和白蛋白未见明显的交叉反应. 109份血清标本用本方法与国外试剂盒同时检测,其相关系数为0.916. 结论: CRP-TRFIA各项指标均达到临床检测要求,可替代国外产品试剂盒,用于临床血清CRP的测定.     

液体芯片技术定量测定人体血清CEA、AFP、NSE和tPSA

目的 应用液体芯片技术,联合定量测定人体血清癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）和前列腺特异性抗原（tPSA）,并对其临床应用进行评价.方法 制备交联微球以及生物素标记抗体,利用双抗体夹心法对60个血清样本进行测定,并将其结果与化学发光免疫分析法（CLIA）作比较.结果 同时检测CEA、AFP、tPSA、NSE的线性范围分别为0.078～200 ng/mL、0.030～30.3 ng/mL、0.007～7.5 ng/mL、0.146～75 ng/mL;最低检测限为26.0 pg/mL、19.7 pg/mL、4.9 pg/mL、73.2 pg/mL;批内精密度CV〈9.0%,批间精密度CV〈13.2%;检测结果与CLIA测值的相关系数r分别为0.986、0.979、0.964、0.958（P〈0.001）.结论 液体芯片技术是一种具有极大优势的新型检测技术.该技术打破传统测定技术每次只能测定一个指标的限制,并且具有高通量、高灵敏度、检测时间短、样本用量少等特点.     

基因芯片技术对结核分枝杆菌耐药性检测的临床应用

目的 评价基因芯片技术对结核分枝杆菌耐药性检测的效果. 方法 选取我院结核科2014年3月至2016年3月收治的涂片阳性的肺结核住院患者238例,取其痰标本,分别用基因芯片、传统的罗氏培养和药敏试验3种方法进行结核分枝杆菌的异烟肼耐药性检测和利福平耐药性检测;把罗氏培养和药敏试验的结果作为金标准,评价基因芯片技术的临床应用价值. 结果 基因芯片技术检测涂片阳性患者痰标本异烟肼耐药的情况与金标准无显著差异(P＞0.05);利福平耐药的情况与金标准相比也无明显差异(p>0.05). 结论 基因芯片能够快速、准确地检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药情况,是一种值得推广的临床实验室检测方法.     

乙型肝炎病毒核心抗体IgM 时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制

目的 利用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术建立乙型肝炎病毒抗HBc-IgM的检测试剂盒.方法 采用捕获法建立抗HBc IgM TRFIA检测试剂盒.对自制试剂盒的各项性能指标进行评估.结果用自制质控品检测分析内和分析间的精密度分别为4.8～7.2%,7.5～8.6%;与抗-HBs,抗-HBc IgG和抗-HBe无交叉反应;对584份血清样本进行检测并与国产酶联免疫法试剂盒对比,结果 显示自制试剂盒的灵敏度更高;300份健康者血清样本检测结果表明,该试剂盒的cutoff值=阴性对照荧光值×3.5.结论 试剂盒各项指标均达到临床检测要求,可替代酶免法试剂盒.     

自制铕标记Free β-hCG—TRFIA试剂盒的临床应用研究

目的 对自制铕标记Free β-hCG-TRFIA定量测定试剂盒进行临床应用研究,为该试剂盒的临床应用提供科学依据.方法 收集血清样本1 000份,用自制试剂盒进行测定,对照试剂盒选用PE公司钐标记Free β-hCG TRFIA试剂盒,复核试剂选用美国Diognastic Automation公司ELISA试剂盒,获取相关目标实验数据,进行"符合率"、"相关性"等统计学分析.结果 以PE公司钐标记法为对照实验,自制试剂盒的高值符合率为78.4%;低值符合率为100%,正常值符合率为95.1%,总符合率为93.8%;两种试剂盒测定值相关性良好,相关系数为0.985.结论 自制试剂盒临床检测性能与现行临床广泛应用的方法相仿,可以满足临床应用的需要.