基于悬浮点阵技术的新型EGFR基因突变检测方法的建立和应用

目的构建基于悬浮点阵技术的新型表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的检测方法,检测并分析非小细胞肺癌(NSCLC)组织中EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)相关的EGFR基因突变状况。方法选取61例经影像学和病理学检查确诊的NSCLC患者作为研究对象,手术后留取新鲜肺癌组织,提取基因组DNA,采用多重聚合酶链式反应(PCR)对组织样本的EGFR基因18、19、20和21号外显子中包含8种高频突变位点的特异片段进行扩增,并经多重连接酶检测反应(LDR)以特异性探针对扩增片段中的突变进行连接,再基于悬浮点阵技术平台对连接产物进行检测,最后通过DNA测序对检测结果进行验证。结果在61例NSCLC组织样本中,运用PCR-LDR联合悬浮点阵技术共检出EGFR基因突变19例,突变率为31.1%,其中外显子19缺失突变E746-A750 del(1)、E746-A750 del(2)各1例,外显子20点突变T790M 1例,外显子21点突变L858R 14例、L861Q2例,经DNA测序验证完全正确。结论运用PCR-LDR联合悬浮点阵技术初步建立了一种新型的EGFR基因突变检测方法,能同时准确检测EGFR基因中的8种高频突变...     

急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞颗粒溶素mRNA定量测定及临床意义

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测乙型肝炎（简称乙肝）患者外周血单个核细胞（PBMC）中颗粒溶素（GNLY）mRNA的表达,探讨GNLY基因表达水平与急性乙肝的关系。方法实时荧光定量RT-PCR分别检测40例急性乙肝患者及100名正常对照的PBMC的GNLY基因表达水平,同时检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平。结果急性乙肝患者发病期mRNA表达显著高于正常对照组（P〈0.01）,恢复期GNLY基因表达与正常对照组差异无统计学意义（P〉0.05）。乙肝患者GNLYmRNA与血清ALT、AST呈正相关。结论实时荧光定量RT-PCR检测GNLY mRNA的表达准确可靠。患者外周血GNLY基因表达水平与急性乙肝的发生发展存在一定的相关性。     

人源M2三联体靶抗原BPO-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

目的用基因工程的方法克隆表达抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的3个靶抗原侧链二氧酸脱氢酶复合体E2（BCOADC-E2）、丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）、2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）及其连接形成的三联体BPO-E2融合蛋白，以用于人原发性胆汁性肝硬化（PBC）的早期发现和临床诊断。方法针对BCOADC-E2、PDC-E2、OGDC-E2的cDNA序列设计引物，从正常人的淋巴细胞中提取RNA，通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段，经测定序列验证后插入表达载体pET28a（＋），构建重组表达载体pET28a（＋）-BCOADC-E2、pET28a（＋）-PDC-E2、pET28a（＋）-OGDC-E2、pET28a（＋）-BPO-E2，转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质。表达蛋白经SDS-PAGE、Western-blot等鉴定。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明，成功地构建了4种重组质粒。IPTG诱导表达后，获得4种融合蛋白。经免疫学鉴定，重组抗原片段具有AMA-M2的免疫原性。结论重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的实验室诊断。     

结核杆菌抗原Rv0173的HLA-A*0201限制性CTL表位的预测及鉴定

目的 鉴定结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)抗原Rv0173中的HLA-A*0201限制性CTL表位.方法 应用数据库SYFPETTHI预测结核杆菌Rv0173中可能存在的HLA-A*0201限制性CTL表位,经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A*0201的亲合力,经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞(PBMCs)对各抗原肽产生的增殖反应,经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性,逐步鉴定Rv0173的HLA-A*0201限制性CTL表位.结果 位于Rv0173氨基酸序列肽3(21-30aa)和抗原肽7(161-170aa)与HLA-A*0201分子具有较高的亲合力,并都能刺激HLA-A*0201阳性个体PBMCs增殖,并诱导产生特异性杀伤活性.结论 肽3(RLSQSADQYL)(21-30aa)和肽7(LLRGGGLVNL)(161-170aa)是抗原Rv0173上HLA-A*0201限制性CTL的优势表位,可作为结核疫苗设计的候选表位.     

自身抗原PDC-E2融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学鉴定

目的：用基因工程的方法克隆表达丙酮酸脱氢酶复合体E2（PDC-E2）融合蛋白,以用于人原发性胆汁性肝硬化（PBC）的早期发现和临床诊断.方法：针对PDC-E2的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体pET28a（＋）,构建重组表达载体pET28a（＋）-PDC-E2,转化大肠杆菌BL21（DE3）后诱导表达蛋白质.表达蛋白经SDS-PAGE、Western blot鉴定.结果：经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PDC-E2重组质粒.IPTG诱导表达后,获得PDC-E2融合蛋白.经免疫学鉴定,重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的免疫原性.结论：获得PBC特异性靶抗原的多肽片段,为PBC的早期发现和临床诊断提供有力工具.     

新型高通量肺癌相关基因甲基化检测方法的建立

Objective To explore a new high-throughput method with internal standards for analyzing the methylation profiles of lung cancer related genes. Methods The promoter sequences of 7 lung cancer related genes were cloned into plasmids and the target segments were amplified by their special primers respectively. The products were treated with M. Sss Ⅰ methylase and bisulfite. The multiplex ligation PCR method was established by designing probes containing CpGpCpG(for methylatedsequence) at the 3' ends and choosing the optimal ligation enzyme, annealing and ligation temperatures. The standard calibrators and clinic samples were tested by fluid chip platform. The results were validated by methylationspecific PCR. Results We successfully set up the standard calibrators for methylation and unmethylaiton of 7 lung cancer related genes and established a multiplex ligation PCR combined with fluid chip method, which was used to detect methylation status of 7 genes simultaneously. The fluorescence value of p16INK4A, APC,DAPK, RARIβ, RASSF1 A, MGMT and GSTP1 methylation standard calibrators were 863,909,703,701,901,1 060 and 885, much higher than that of unmethylation standard calibrators. The results were consistent with the results of methylation-specific PCP. ConclusionThe new high-throughput method can be used to evaluate the methylation status of 7 lung cancer related genes simultaneously and might be useful for clinical practice.     

颗粒溶素酶联免疫吸附测定法的建立及临床初步应用

颗粒溶素（granulysin，GNLY）是脂结合蛋白-皂素样蛋白（saposin-like protein，SAPLIP）家族成员之一，具有广谱细胞毒活性，在抗感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。因此，对GNLY血清表达水平准确定量具有重要意义。本中心建立GNLY血清水平酶联免疫吸附测定（ELISA）法，并检测30名正常人及30例传染性单核细胞增多症（IM）患者血清GNLY水平，以进行不同疾病期比较分析，并探讨GNLY在感染性疾病诊断和临床实时监测中的应用价值。     

利用重组人源靶抗原二联体OP检测M2抗体及临床意义

目的 利用重组抗原检测自身免疫病患者血清中抗OP自身抗体并探讨其临床意义。方法 经Ni-NTA柱纯化表达重组OP融合蛋白作为抗原，分别用免疫印迹法（IBT）和酶链免疫吸附试验（ELISA）检测70份PBC患者血清，80份其它肝病患者血清，80份自身免疫病患者血清和100份正常人血清。结果 70份PBC患者血清中检测出阳性患者62例，阴性8例，阳性率为87．6％。其它肝病患者血清、自身免疫病患者血清和正常人血清均为阴性。重组抗原检测M2抗体有一定的敏感性。结论 利用重组抗原OP检测M2抗体，有较好的敏感性及特异性，有助于PBC的临床诊断。     

某驻军部队军人睡眠剥夺对动态血压的影响

目的 探讨驻军部队军人在急性睡眠剥夺后动态血压各指标的变化.方法 选择驻军某部队成建制60例健康军人进行研究,采用24h整夜完全睡眠剥夺方法,在睡眠剥夺过程中应用动态血压记录仪监测血压各指标.结果 睡眠剥夺后,(1)夜间血压负荷增高,夜间收缩压负荷为(55.3±37.0)％,夜间舒张压负荷为(26.5±28.8)％.(2)血压、心率昼夜节律消失,24h收缩压夜间血压下降(0.5±4.8)％,24 h舒张压夜间血压下降(3.8±7.4)％,血压呈非杓型;夜间/日间心率下降率为4％,为非杓型心率.(3)日间平均心率与日间平均收缩压负荷呈正相关(r=0.269,P＜0.05);夜间平均心率与夜间舒张压负荷呈正相关(r=0.338,P＜0.01).(4)血压变异性增加.结论 24h完全性睡眠剥夺可导致健康成年男性夜间血压负荷增重,昼夜节律频率变化的消失,是发生高血压的危险因素,可能会增加心血管事件的风险.     

腺苷脱氨酶和癌胚抗原联合检测在结核性与恶性肿瘤胸腔积液鉴别诊断上的价值

目的为鉴别结核性和恶性肿瘤胸腔积液提供一种比较快速及有实用价值的检测方法。方法采用速率法和化学发光法分别检测65例结核性胸腔积液患者和60例恶性肿瘤胸腔积液患者胸腔积液的腺苷脱氨酶(ADA)活性和癌胚抗原(CEA)含量。结果结核组及恶性肿瘤组胸腔积液ADA活性分别为(52.9±22.8)U/L和(13.8±5.7)U/L,二者比较差异有统计学意义(P0.01)。恶性肿瘤组胸腔积液CEA含量为(37.8±17.6)ng/mL,明显高于结核组[(7.9±2.8)ng/mL](P0.01)。结论胸腔积液ADA与CEA对结核性和恶性肿瘤胸腔积液具有鉴别诊断价值。