从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体(摘要)

目的:从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg Fab噬菌体抗体。方法:用固相化HBsAg对所构建的噬菌体抗体库进行三轮淘筛,从中筛选人抗HBsAg Fab噬菌体抗体。材料:①SB培养基:每升培养基含细菌培养用胰化蛋白胨30g,酵母提取物20g,Mops 1g,pH7.0。②SOC培养基:每升培养基含细菌培养用胰化蛋白胨20g,酵母提取物5g,NaCl 0.5g,250mmol/L KCl溶液10ml,pH7.0。临用前加入2mol/L MgCl_2溶液5ml和1mol/L葡萄糖溶液20ml。③血源纯化HBsAg。④     

从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAg的Fab噬菌体抗体

目的从人源性噬菌体抗体库中筛选人抗HBsAgFab噬菌体抗体。方法用固相化HBsAg对所构建的噬菌体抗体库进行三轮淘筛,从中筛选人抗HBsAgFab噬菌体抗体。结果第三轮淘筛后洗脱下来的噬菌体,较第一轮增加80倍,含有抗体轻链基因和重链基因的克隆,也由淘筛前的17%增至100%,经ELISA证实,筛选到的抗HBsAg噬菌体抗体对HBsAg具有良好的结合活性,而与牛血清白蛋白和HAVAg等无关抗原均不反应。结论HBsAg对抗体库的淘筛,富集了表面呈现抗HBsAg的单克隆抗体的噬菌体。     

链霉蛋白酶P、糖苷酶对低分子量肝细胞生长素生物活性的影响

目的研究链霉蛋白酶P、糖苷酶对低分子量肝细胞生长素生物活性的影响。方法用链霉蛋白酶P、N-糖苷酶F、O-糖苷酶分别对低分子量肝细胞生长素消化,观察消化后低分子量肝细胞生长素以及未经消化的低分子量肝细胞生长素和促肝细胞生长素对人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞的增殖作用,用3H-胸腺嘧啶核苷掺入法测定这些细胞的增殖情况。结果低分子量肝细胞生长素与促肝细胞生长素对人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞均有明显增殖作用（P〈0.01）;低分子量肝细胞生长素与促肝细胞生长素均对人肝癌细胞株QGY增殖作用最明显（P〈0.01）;低分子量肝细胞生长素增殖作用较促肝细胞生长素明显（P〈0.01）。低分子量肝细胞生长素经链霉蛋白酶P、O-糖苷酶消化前后对人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞增殖作用无影响（P〉0.05）;低分子量肝细胞生长素经N-糖苷酶F消化后对人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞增殖作用明显减弱,差异有统计学意义（P〈0.01）。结论低分子量肝细胞生长素促进人肝癌细胞株QGY、HepG2、原代大鼠肝细胞增殖作用比促肝细胞生长素更显著。     

利用5''''-RACE技术进行人肝再生增强因子相互作用肽cDNA5''''末端快速扩增及序列分析

目的:利用5'-RACE技术进行人肝再生增强因子(hALR)相互作用肽cDNA5'末端快速扩增并进行序列分析.方法:按照5'-RACE试剂盒(Takara)操作流程进行hALR相互作用肽cDNA5'末端快速扩增,用BLAST技术对扩增序列进行生物信息学分析.结果:成功获取487bp的5'-RACE反应产物,其中5'端延伸了275bp,同源序列分析表明与人Citron激酶mRNA高度同源.结论:5'-RACE技术可以用于快速有效扩增已知部分cDNA序列的5'末端,Citron激酶可能是与hALR具有相互作用的蛋白.     

大鼠肝再生增强因子编码区的cDNA克隆和原核表达

目的：克隆大鼠肝再生增强因子（ＡＬＲ）编码区ｃＤＮＡ并进行原核表达。方法：提取新生大鼠肝脏总ＲＮＡ为模板，以寡聚ｄＴ为引物逆转录合成第一链ｃＤＮＡ，再以我们设计的ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ扩增获取大鼠肝再生增强因子编码区双链ｃＤＮＡ；以基因重组技术构建大鼠ＡＬＲ的原核表达质粒，然后将重组表达质粒转化至大肠杆菌内以ＩＰＴＧ诱导表达。结果：成功克隆出大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ，其序列与以前报道的完全一致；构建的大鼠ＡＬＲ原核表达重组质粒在大肠杆菌内高效表达ｒＡＬＲ融合蛋白，其表达量占菌体蛋白３０％。结论：大鼠肝再生增强因子编码区ｃＤＮＡ的克隆及其在大肠杆菌的高效表达为ＡＬＲ的深入研究奠定了基础。     

转化生长因子β1及基质金属蛋白酶抑制剂1、2siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的 用RNA干扰技术,分别以转化生长因子(TGF)β 1、基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)-1和TIMP-2为靶基因,设计并构建针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,并在体外检测其对大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)的TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因表达的抑制情况.方法 设计合成TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2的siRNA并与含绿色荧光蛋白的pGenesil-1载体连接,构建siRNA真核表达载体,并测序鉴定.体外转染HSC-T6细胞,观察转染效率,并用荧光定量PCR以及Western blot分析对目的 基因的抑制效率.组间比较用方差分析,两两比较用q检验.结果 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体.体外成功转染HSC-T6细胞,转染后的细胞TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2 mRNA表达分别下调63.4%±8.0%,64.5%±9.0%,55.0%±17.0%(F值分别为17.55、128.42、210.36,P值均＜0.01),TGF β 1、TIMP-1及TIMP-2蛋白表达分别下降57.8%±3.0%,55.1%±5.0%,49.3%±1.0%(F值分别为130.75、159.09、35.72,P值均＜0.01).结论 成功构建了针对TGF β 1、TIMP-1和TIMP-2基因的siRNA真核表达载体;将重组载体成功转染入体外培养的HSC-T6细胞,并显著抑制了目的 基因的表达;为进一步研究其在体抑制表达提供了实验工具.

Abstract：

Objective To construct the siRNA eukaryotic expression vectors targeting on TGF β1,TIMP-1 and TIMP-2 and to investigate the inhibitory efficiency of target genes expression on rat hepatic stellate cell in vitro. Methods The siRNA cDNA sequences ofTGF β 1, TIMP-1 and TIMP-2 were designed,synthesized and inserted into plasmid pGenesil-1 respectively to generate eukaryotic expression plasmids.The plasmids were transfected into HSC T6 cells in vitro and the inhibitory efficiency of target genes expression was observed with real-time PCR and Western blot. Results The eukaryotic expression vectors were constructed successfully. The expressions of TGF β1 mRNA, TIMP-1 mRNA and TIMP-2mRNA in siRNAtransfected groups were decreased by 63.4% ± 8.0%, 64.5% ± 9.0% and 55.0% ± 17.0% respectively and the expressions of TGF β1 protein, TIMP-1 protein and TIMP-2 protein were decreased by 57.8% ± 3.0%,55.1% ± 5.0%, 49.3% ± 1.0% respectively as compared to the control groups. Conclusions The siRNA eukaryotic expression vectors constructed targeting on TGF β1, TIMP-1 and TIMP-2 could reduce the expressions of target genes and they might be able to used for the exploration of new anti-fibrosis drugs genetically.     

肝再生增强因子在缺血再灌注肾损伤中的表达及其对p38信号通路的影响

目的:观察缺氧及缺氧复氧状态下大鼠肾小管上皮细胞中肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration,ALR)的表达变化,以及对细胞p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kincses,MAPK)信号通路的影响,探讨ALR对肾脏保护的作用机理.方法:将...     

抗人肝再生增强因子单克隆抗体对人肝癌细胞株HepG2增殖活性的影响

目的:检测人肝癌细胞株HepG2细胞有无人肝再生增强因子(hALR)的表达,利用hALR特异性的单克隆抗体(anti-hALR McAb)结合hALR,观察其阻断hALR的作用后,对人肝癌细胞株HepG2细胞的增殖活性的影响.方法:用免疫细胞化学以及RT-PCR的方法检测HepG2细胞hALR蛋白及mRNA的表达;用3H-TdR掺入法检测hALR特异性单克隆抗体中和hALR后HepG2细胞的增殖情况.结果:①HepG2细胞有hALR的表达.②抗hALR单克隆抗体特异性地阻断hALR的作用后可部分抑制肿瘤细胞自主性生长.结论:抗hALR单克隆抗体能部分抑制肿瘤细胞自主性生长;hALR通过自分泌方式参与了肝癌细胞的自主性生长.     

同种肝细胞移植细胞排斥反应机理及肝再生增强因子的作用

目的 探讨同种异体肝细胞腹腔内移植治疗急性肝衰竭大鼠的细胞排斥反应机制及肝再生增强因子(ALR)的免疫作用.方法 采用D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭(ALF),诱导后24 h,随机分成5组.工组:注射生理盐水;Ⅱ组:单纯移植肝细胞;Ⅲ组:肝细胞移植联合CsA;Ⅳ组:肝细胞移植联合ALR;V组:注射ALR;肝细胞和药物均腹腔内注射.观察大鼠的存活率、组织学改变、移植肝细胞存活情况,检测大网膜CD4、CD8、CD68.结果 Ⅳ组存活率显著高于Ⅰ组(66.7% vs 0%,P=0.001),余组间无差异.Ⅳ组移植肝细胞存活时间更长.d1-2大网膜CD68阳性率Ⅱ组高于Ⅰ、Ⅳ组;CD4、CD8阳性率Ⅰ、Ⅱ组均高于Ⅳ、V组,且Ⅱ组CD4阳性率高于Ⅲ组.d14大网膜CD4、CD8、CD68阳性率各组间无差异,但Ⅳ组CD4、CD8、CD68阳性率d1-2均低于d14的,Ⅱ组CD68阳性率d1-2高于d14的.结论 同种肝细胞腹腔内移植联合ALR能提高ALF大鼠的存活率,同种肝细胞移植能引起CD4、CD8、CD68介导的细胞免疫,ALR能有效的抑制同种异体细胞免疫,促进移植肝细胞存活和增殖.