核糖体展示技术

克隆展示技术(cloning display)是一种筛选蛋白质强有力的工具,该技术将基因型和蛋白表型联系在一起,利用目标蛋白的特异性配基可从蛋白质展示文库中筛选出目标蛋白和相应基因序列.     

肝再生增强因子,细胞色素P450与人肝癌细胞在体外耐药的关系

目的:研究肝癌顺铂耐药细胞HepG2/cDDP中人肝再生增强因子(Human augmenter of liver regeneration,hALR)对细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)表达的影响,观察ALR是否通过作用CYP450与肝癌细胞耐药的形成有关.方法:建立体外肝癌顺铂耐药细胞...     

肝再生增强因子对大鼠脾单个核细胞增殖及IL-2产生能力的影响

目的：通过体外实验探讨rALR对脾脏单个核细胞是否具有直接的免疫调控作用和作用特点。方法：以3H-TdR掺入法检测脾脏单个核细胞在不同处理情况下的增殖状况：①不同剂量的rALR与5μg/ml ConA同时加入；②5μg/ml ConA预刺激脾脏单个核细胞10和32小时后，再加入30μg/ml rALR；③30μg/ml rALR预处理脾脏单个核细胞至30小时，再加5μg/ml ConA刺激。以环孢霉素A作为阳性对照，以转空质粒的酵母表达上清提取物作为阴性对照。以放免法检测培养上清中IL-2分泌情况。结果：不同剂量的rALR与ConA同时加入时，能以剂量依赖方式明显抑制ConA对脾脏单个核细胞的促增殖作用。ConA预刺激脾脏单个核细胞10、32小时后，再给予30μg/ml rALR仍可明显抑制脾脏单个核细胞的增殖，但用30μg/ml rALR预处理脾脏单个核细胞至30小时，并不影响脾脏单个核细胞对ConA刺激的反应能力。ConA＋rALR（30μg/ml）组的IL-2分泌在24小时明显低于ConA组。结论：rALR对ConA活化的脾脏单个核细胞增殖有明显的抑制作用，而对未活化的脾脏单个核细胞则无明显影响，提示未经抗原激活的免疫细胞可能不表达ALR受体。     

TGF-β1与肝纤维化的关系再探讨

转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)是一簇具有多种功能的蛋白多肽,广泛存在于动物正常组织细胞以及转化细胞中,以骨组织和血小板中含量最为丰富.目前至少发现有5种异构体,分别命名为TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5[1](其中肝脏中含量最高并有牛物活性的是TGF-β1).正常情况下,TGF-β1的表达极少,而肝损伤时其表达明显增加,是肝纤维化形成的关键因子.     

RNA干扰技术:白血病基因治疗的新途径

RNA干扰(RNAi)是双链RNA特异抑制靶基因表达的转录后基因沉默机制,它为白血病的 基因治疗开辟了一条新途径。本文就此技术在白血病基因治疗中的应用进行综述。     

丙酮酸乙酯抑制脓毒症时HMGB1释放的分子机制

【目的】 探讨丙酮酸乙酯(EP)抑制脓毒症巨噬细胞表达和释放HMGB1的相关分子机制?【方法】将小鼠腹腔巨噬细胞株RAW264.7分为LPS和LPS+ EP组,分别采用100 ng/mL LPS和100 ng/mL LPS+ 5 mmol/L EP刺激,于刺激后不同的时间点,Western blot检测细胞总蛋白内p-p38MAPK?CBP的含量变化以及胞质和胞核内NF-κB的含量;用免疫细胞化学?激光共聚焦显微镜观察培养细胞内p-p38MAPK?NF-κB和CBP的变化;Real-time PCR检测培养细胞HMGB1的mRNA水平,ELISA检测培养上清HMGB1的蛋白含量?【结果】 LPS和LPS+ EP刺激后2~6 h,细胞内p-p38MAPK蛋白含量逐渐增加,但LPS+ EP组p-p38MAPK蛋白含量明显低于LPS组;NF-κB在细胞质内的含量逐渐减少,而在细胞核内的含量逐渐增多,而LPS+ EP组NF-κB从胞质到胞核的移位明显弱于LPS组;细胞内CBP的蛋白含量逐渐增加,但LPS+ EP组明显低于LPS组?随着p-p38MAPK?NF-κB和CBP等蛋白的变化,LPS和LPS+ EP刺激后24?36和48 h,LPS+ EP组细胞内HMGB1 mRNA表达比LPS组明显减少;在LPS和LPS+ EP刺激后18~48h,LPS+ EP组培养上清中HMGB1蛋白含量明显低于LPS组?【结论】 EP通过抑制单核-巨噬细胞内的信号分子p-p38MAPK?NF-κB?和 CBP的表达,从而抑制LPS诱导单核-巨噬细胞表达和释放HMGB1?     

肝再生增强因子在急性肾衰大鼠模型肾组织中的表达及意义

目的 探讨在庆大霉素所致急性肾衰大鼠肾组织中肝再生增强因子(ALR)的表达部位、表达量变化及其与肾小管上皮细胞增生的关系。方法 建立由庆大霉素所致的中毒性急性肾衰大鼠模型，采用免疫组织化学方法检测实验第4、6、8、12、16、21天肾组织中肝再生增强因子的表达和分布情况以及小管上皮细胞增生程度。结果 ALR在正常肾组织内主要表达于髓质区的髓襟、远曲小管和集合管；在实验第4天除了在上述部位表达增强外，在皮质区损伤和再生的近端小管上皮细胞有弱表达，第8天在上述部位表达最强，第12天在皮、髓质区表达开始下降，至21d几乎恢复到正常水平；在正常及肾衰大鼠肾小球内未见ALR表达。对照组肾小管上皮细胞增生指数(PI)为0．6％，实验组第4、6、8、12、16、21天的PI分别为10．4％、17．4％、34．2％、19．2％、8．4％、3．8％。皮质、髓质区ALR表达阳性的面积与小管上皮细胞PI成正相关(r分别为0．913和0．954，P＜0．01)。结论 ALR在庆大霉素所致中毒性急性肾衰大鼠肾脏组织表达明显增强，且与肾小管上皮细胞增生程度成正相关。提示肝再生增强因子参与了中毒性急性肾衰的病理改变过程，其作用可能与肾小管上皮细胞再生有关。     

人肝再生增强因子真核表达及其对顺铂诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的：构建人肝再生增强因子（human augmenter of liver regeneration,hALR）15kD亚型的真核表达系统,并探索ALR对顺铂（Cisplatin,DDP）诱导的人肝癌细胞株QGY凋亡的影响。方法：用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）方法和基因重组技术,从重组质粒pPIC9K-rhALR中扩增出编码rhALR基因片段,将其克隆入pPICZαA质粒中构建重组质粒pPICZα－A-rhALR。重组质粒SacⅠ酶切线性化后电转入酵母GS115中,并在1%的甲醇诱导下表达。表达上清蛋白经Western blot（ALR多克隆抗体和His-tag标签抗体）鉴定和镍柱亲和层析纯化。MTS试剂检测rhALR体外对人肝癌细胞（HepG2、QGY）的促增殖活性,及流式细胞仪检测rhALR在顺铂诱导QGY细胞凋亡中的抗凋亡作用。结果：PCR、双酶切、DNA测序均鉴定重组质粒构建与预期一致。分泌表达的rhALR约占上清总蛋白的70%,目的分子量约17 kD,Western blot均可见单一条带。纯化后的rhALR对HepG2和QGY的体外促增殖作用呈浓度依赖性增强（HepG2组：F=246.729,P=0.000;QGY组：F=246.004,P=0.000）,且在QGY细胞顺铂诱导凋亡时也发挥着浓度梯度式抗凋亡作用（F=101.061,P=0.000）。结论：成功构建高效分泌表达rhALR的pPICZα－A-rhALR GS115真核表达系统;体外实验证实rhALR对顺铂诱导人肝癌细胞有呈浓度依赖性的抗凋亡作用。     

基质金属蛋白酶抑制剂1和2 siRNA对CCl4诱导的肝纤维化大鼠Smad7蛋白表达的影响

目的：研究基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMP）1和2的siRNA对CCl4诱导的肝纤维化大鼠Smad7蛋白表达的影响。方法：采用前期构建的TIMP-1 siRNA、TIMP-2 siRNA治疗肝纤维化大鼠的肝脏组织作为研究对象,分为正常组、模型组、阴性对照组（0.25 mg/kg非特异性靶序列）、TIMP-1 siRNA 0. 25 mg/kg组和TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组。Real-time PCR法检测Smad7的mRNA表达;免疫组织化学、Western blot检测Smad7的蛋白表达。结果：Real-time PCR结果显示TIMP-1 siRNA 0.25 mg/kg组（59.7±3.3）%、TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组（60.2±3.4）% Smad7的mRNA表达量均较模型组（28.0±1.6）%、阴性对照组（28.6±1.7）%明显增加（P=0.000）;免疫组织化学结果显示TIMP-1 siRNA 0.25mg/kg组（8.55±0.67）、TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组（8.23±0.85）Smad7的蛋白表达量均较模型组（4.25±0.53）、阴性对照组（4.19±0.55）明显增加（P=0.000）。Western blot结果显示TIMP-1 siRNA 0.25 mg/kg组（0.706±0.039）、TIMP-2 siRNA 0.25 mg/kg组（0.698±0.038）Smad7的蛋白表达量均较模型组（0.278±0.013）、阴性对照组（0.285±0.014）明显增加（P=0.000）。结论：TIMP-1 siRNA、TIMP-2 siRNA对于肝纤维化Smad7的表达有促进作用。