水蛭素在毕赤酵母中的分泌表达

目的:构建水蛭素毕赤酵母表达载体,获得重组蛋白在毕赤酵母中的分泌型表达. 方法: 通过PCR扩增获得水蛭素HV2, HV2-N47K基因,将序列正确的基因序列插入酵母表达载体pPIC9α分泌信号下游,再亚克隆入高拷贝载体pPIC9K,构建表达质粒pPIC9K-HV2, pPIC9K-HV2-N47K. 重组质粒转化宿主菌GSM1168,G418抗性筛选高拷贝的稳定表达菌株,经甲醇诱导表达并对表达产物进行鉴定. 结果: 成功构建了水蛭素毕赤酵母表达载体,获得水蛭素在毕赤酵母中的分泌型表达,表达产物具有抗凝血酶活性. 结论: 水蛭素在毕赤酵母中获得分泌型表达,为研究新药奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

人杀菌/通透性增强蛋白活性片段基因在CHO细胞中的表达

目的获得人杀菌/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,BPI)N端活性片段蛋白,为BPI结构和功能的研究提供有力的工具。方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPIN端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染CHO细胞并筛选阳性克隆,免疫荧光法鉴定重组BPI的表达和免疫学活性。结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,与文献报道的序列相比,有6个核苷酸差异。转染筛选的阳性CHO细胞克隆表达产物能够被抗BPI的单克隆抗体所识别。结论BPI活性片段表达载体的构建及真核表达成功,为BPI功能的研究奠定了基础。     

肝素结合血凝素蛋白在结核病诊断中的应用研究

目的制备天然和重组肝素结合血凝素（HBHA）蛋白,探讨其在结核杆菌感染诊断中的应用价值。方法用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段。结核分枝杆菌HBHA基因克隆至PQE80L克隆表达载体中,序列测定正确后,将其转化到大肠埃希菌BL-21中,再经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达HBHA蛋白,表达蛋白经SDS-PAGE及免疫印迹法分析后,亲和层析法纯化蛋白,并以此免疫新西兰兔制备多克隆抗体。同时将7H9液体培养基中的卡介苗（BCG）培养至稳定生长期,用CL-6B层析柱分离纯化HBHA蛋白。观察抗体对不同浓度天然HBHA和重组HBHA诱导BCG聚集效应的影响。结果所得天然和重组HBHA蛋白均有诱导BCG聚集的作用,并均可被多克隆抗体抑制。结论成功获得天然HBHA和重组HBHA蛋白;证实了两者均具有促进BCG聚集的功能,并可被由重组HBHA诱导产生的多克隆抗体所抑制。从而为进一步研究HBHA的临床诊断价值提供了实验依据。     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

结直肠癌药物敏感基因检测与治疗的研究进展

个体化治疗是指通过患者体内的有关药物作用靶点、路径、代谢等评估药物对患者可能的作用,提高治疗的针对性、避免反复尝试与不良反应,提高用药的安全性和有效性。通过药物敏感性基因检测,实现对结直肠癌化疗药物敏感性和疗效预测,进而优化治疗方案,提高疗效、减少无效治疗。结直肠癌患者选择化疗方案或靶向治疗之前进行药敏基因检测是实现个体化治疗的必经之路。     

应用RNA干扰技术阻断PC-3细胞中survivin基因的表达

目的:用真核转录载体pS ilencerTM3.1-H1 neo构建针对survivin基因的重组真核转录载体,并转染前列腺癌细胞系PC-3,通过RNA干扰(RNA i)阻断PC-3细胞中survivin基因的表达,并研究survivin基因沉默后对PC-3细胞凋亡产生的影响。方法:将合成的DNA正义链及反义链变性、退火,形成的双链DNA与pS ilencerTM3.1-H1 neo线性质粒用T4DNA连接酶连接,重组质粒经酶切及DNA测序鉴定后,用脂质体法转染PC-3细胞,通过RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验检测survivin的表达变化,并用流式细胞术检测转染后PC-3细胞的凋亡变化,MTT法检测细胞生长速度的变化。结果:酶切及测序证实设计合成的DNA已正确插入载体。RT-PCR、免疫印迹和免疫组织化学染色实验表明,pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3重组载体有效地阻断了PC-3细胞中survivin基因的表达,survivin基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调(P<0.01),转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。结论:成功构建了针对survivin基因的真核转录载体pS ilencer3.1-SVV1、pS ilencer3.1-SVV2和pS ilencer3.1-SVV3,后两者可有效地阻断前列腺癌细胞系PC-3细胞中survivin基因的表达,并使转染后PC-3细胞的凋亡增加了10%~15%,细胞生长速度明显变慢。     

医院内感染病原菌的分布及耐药状况分析

目的：了解医院内感染病原菌的分布及耐药状况,为临床合理用药提供依据。方法常规培养分离鉴定,应用VITEKI和phoenix100全自动细菌鉴定分析仪系统鉴定菌株;药敏试验采用K-B纸片扩散法,根据CLSI规定的标准进行。结果2013年共检出6681株病原菌,临床分离的细菌主要以革兰阴性菌为主,大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌为分离菌株的前五位,分离率分别为17.2%、14.19%、13.31%、12.26%、9.52%,产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分离率分别为56.94%、41.53%;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分离率为59.18%。检出耐万古霉素、耐利奈唑胺的金黄色葡萄球菌各1株。结论大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球仍是临床院内感染的重要病原菌,且对多种抗生素都处于比较高水平的耐药率,有逐年升高的趋势。临床微生物实验室应加强医院内重要感染病原菌的耐药性检测,临床应根据药敏结果和患者自身的感染状况制定出合理的个性化治疗方案,并高度重视多药耐药菌感染者的有效隔离,以防控耐药菌的扩散和流行。     

survivin启动子与PSMA启动子/增强子在前列腺癌细胞系中的转录活性比较

目的:通过研究并比较前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因启动子、增强子和survivin基因启动子在不同前列腺癌细胞系(LNCaP和PC-3细胞)中的转录活性,为前列腺癌的靶向性基因治疗提供依据。方法:采用PCR扩增PSMA基因的启动子、增强子和survivin基因启动子,分别克隆入pGL3-Basic,脂质体转染前列腺癌细胞和张氏肝细胞,检测各启动子在细胞中的转录活性。结果:survivin基因启动子在前列腺癌细胞中均具有较强活性,均明显高于PSMA启动子/增强子,其中S2pro启动活性最强,达到CMV启动子活性的1/3,然而,survivin启动子及PSMA启动子/增强子在肝细胞系中几乎不表达。结论:survivin启动子在前列腺癌细胞中具有较强启动活性,可望成为新的前列腺癌靶向性基因治疗工具。     

水蛭素基因DNA家族改组方法的建立

目的:运用DNA家族改组技术,增加改组分子库的多样性.方法:取水蛭素HV1、HV2、HV3基因等量混合,用DNase Ⅰ消化,回收50bp左右的片段,再经无引物和有引物PCR扩增获得与原基因大小相同的改组分子,将其与载体连接获得水蛭素改组文库,DNA测序观察改组效果.结果:随机挑取3个克隆均为3种模板基因片段的杂合体,表明改组分子库多样性较好,改组方法较为成功.结论:水蛭素基因DNA家族改组方法的成功建立为进一步筛选高活性的水蛭素奠定了基础.