SHV-71型β-内酰胺酶的酶动力学研究

目的对临床分离的鲍曼不动杆菌所产SHV-71型β-内酰胺酶的编码基因进行序列分析,研究其对多种β-内酰胺类抗生素的酶动力学参数,并观察pH、温度、底物浓度及酶抑制剂对酶活性的影响。方法PCR扩增SHV型酶的编码基因。将SHV的PCR产物与pMD18-T载体连接,测定它们的核苷酸序列,并将SHV-71型酶基因克隆至表达载体pET-41b(+),转化至宿主菌大肠埃希菌BL21(DE3)中。以IPTG诱导其表达并纯化,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达情况。用分光光度计测定SHV-71型酶对多种β-内酰胺类抗生素的动力学参数,以及pH、温度、底物浓度及酶抑制剂对酶活性的影响。结果SHV-71型酶对第一、二、三代头孢菌素类抗生素的相对最大水解速度及相对水解效率均较高,而对青霉素类和碳青霉烯类抗生素的相对最大水解速度及相对水解效率均较低。该酶在pH7.4、37℃的活性最高;底物浓度低于120μmol/L时,反应初速度随底物浓度增加而呈线性增加,底物浓度大于120μmol/L时,酶活性反而受抑;克拉维酸和三唑巴坦对SHV-71型酶有抑制作用。结论根据SHV-71型酶的酶学特点,我们推测SHV-71型酶为超广谱β-内酰胺酶。     

阴沟肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因及氨基糖苷类修饰酶基因研究

目的 了解临床分离的40株阴沟肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因及氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因存在状况.方法 在2003年9月至2004年11月从解放军第98医院住院患者中分离40株阴沟肠杆菌,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析5种16S rRNA甲基化酶基因(armA、rmtA、 rmtB、rmtC和rmtD)和9种AMEs基因[aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(3)-Ⅲ、aac(3)-Ⅳ、aac(6'')-Ⅰ b、aac(6'')-Ⅱ、ant(3'')-Ⅰ、ant(2'')-Ⅰ和aph(3'')-Ⅵ].结果 40株阴沟肠杆菌中,6种基因rmtB、aac(3)-Ⅱ、aac(6'')-Ⅰ b、ant(3'')-Ⅰ、ant(2'')-Ⅰ和aph(3'')-Ⅵ的阳性株数分别为5株(12.5%)、11株(27.5%)、29株(72.5%)、13株(32.5%)、2株(5.0%)和2株(5.0%);其余8种基因均阴性;AMEs基因总阳性率为85.0%(34/40).对29株aac(6'')-Ⅰ b基因PCR阳性产物进行测序,证实有7株(24.1%)单独携带aac(6'')-Ⅰ b-cr双功能酶基因(GenBank:EF375620、EU159121),18株(62.1%)单独携带aac(6'')-Ⅰ b-Snzhou(苏州型,EU085533),3株(10.3%)同时携带aac(6'')-Ⅰ b-Suzhou及aac(6'')-Ⅰ b-cr 2种亚型,仅1株(3.4%)为aac(6'')-Ⅰ b经典型.结论 临床分离的40株阴沟肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因阳性率较低而AMEs基因阳性率很高,至少存在5种AMEs基因.     

鲍曼不动杆菌ADC型AmpC β-内酰胺酶基因研究

目的了解浙江湖州解放军第98医院自临床分离的鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）中ADC型AmpC β-内酰胺酶基因（blaADC）存在状况。方法收集2000年7月-2002年12月所分离到的60株鲍曼不动杆菌，采用聚合酶链反应及序列分析的方法分析blaADC基因。结果60株中有59株blaADC基因呈阳性（98．3％），序列分析表明4号菌株（原始编号HZB3944）blaADC基因为-新亚型，其核酸序列已登录GenBank（注册号EF569589）。结论鲍曼不动杆菌中blaADC基因阳性率很高，产ADC型AmpC β-内酰胺酶是本组菌株对β-内酰胺类抗生素耐药的重要原因之一。     

4种非发酵糖革兰阴性杆菌氨基糖苷类修饰酶基因研究

目的 分析解放军第98医院临床分离的4种非发酵糖革兰阴性杆菌中氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因存在状况.方法 在2000年7月至2004年10月间从临床分离60株鲍曼不动杆菌(Ab)、30株铜绿假单胞菌(Pa)、19株嗜麦芽窄食单胞菌(Sm)和15株黄杆菌属细菌(Fb),采用PCR及序列分析法分析9种AMEs基因aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(3)-Ⅲ、aac(3)-Ⅳ、aac(6')-Ⅰ、aac(6')-Ⅱ、ant(3')-Ⅰ、ant(2')-Ⅰ和aph(3')-Ⅵ.结果 Ab、Pa、Sm和Fb中9种AMEs基因总阳性率分别为81.7%、86.7%、10.5% 和0.0%.Ab、Pa和Sm中分别检出8种、5种和2种基因.aac(3)-Ⅲ基因均阴性,各菌种中阳性率最高的基因分别是Pa中aac(3)-Ⅱ(76.7%)、Ab中ant(3')-Ⅰ (60.0%)、Sm 中aac(6')-Ⅱ和ant(2')-Ⅰ(均为10.5%).结论 临床分离的非发酵糖革兰阴性杆菌(除Fb外)中至少存在8种AMEs基因,Pa及Ab中AMEs基因携带率高.     

阴沟肠杆菌多重耐药基因及亲缘性分析

近年来阴沟肠杆菌已成为医院感染的重要病原菌，多重耐药日益严重，特别是对碳青霉烯类抗生素耐药株的出现令抗菌感染治疗相当困难。为了解本院临床分离的阴沟肠杆菌中抗菌药物耐药基因存在状况及菌株亲缘性，我们采用分子生物学等技术进行了研究。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子遗传标记及β-内酰胺类抗生素耐药相关基因研究

目的 了解临床分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IRPa)中Ⅰ类整合子及β-内酰胺类抗生素耐药相关基因存在状况.方法 自临床分离28株IRPa,采用聚合酶链反应及序列分析的方法检测Ⅰ类整合子遗传标记(intI1和qacE△1-sul1基因)及18种β-内酰胺类抗生素耐药相关基因.结果 28株中,intI1、qacE△1-sul1、blaTEM、blaOXA-10群和blaCARB基因阳性株数(%)分别为21株(75.0%)、24株(85.7%)、20株(71.4%)、1株(3.6%)和1株(3.6%),经序列分析分别确认为blaOXA-10(GenBank注册号:AY841859)和blaCARB-3.25株(89.3%)oprD基因缺失,blaIMP、blaVIM、blaSHV、blaPER、blaVEB、blaGES、blaMIR、blaDHA、blaSPM、blaGIM、blaOXA-1群、blaOXA-2群、blaBEL-1、blaCTX-M-1群基因均阴性.结论 临床分离的IRPa中Ⅰ类整合子携带率很高,至少存在blaTEM、blaOXA-10和blaCARB-3种β-内酰胺酶基因,oprD基因缺失突变是其对亚胺培南耐药的主要原因.     

鲍曼不动杆菌16S rRNA甲基化酶基因及氨基糖苷类修饰酶基因研究

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)是条件致病菌,但近年来已出现多重耐药株,被称为MDR-A6.MDR-Ab已是医院感染病原菌中最常见菌种之一,并且对包括β-内酰胺类和氨基糖苷类在内的常用抗菌药物呈现多重耐药性.     

阴沟肠杆菌中发现氨基糖苷类-氟喹诺酮类修饰酶基因aac(6′)-Ib-cr

对本院临床分离的阴沟肠杆菌进行耐药机制研究时，发现一株携带aac（6＇）-Ib-cr基因，该基因产物不仅对氨基糖苷类抗生素有修饰作用，对氟喹诺酮类也有修饰作用。     

阴沟肠杆菌16S rRNA甲基化酶基因及氨基糖苷类修饰酶基因研究

目的 了解临床分离的40株阴沟肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因及氨基糖苷类修饰酶(AMEs)基因存在状况.方法 在2003年9月至2004年11月从解放军第98医院住院患者中分离40株阴沟肠杆菌,采用聚合酶链反应(PCR)及序列分析的方法分析5种16S rRNA甲基化酶基因(armA、rmtA、rmtB、rmtC和rmtD)和9种AMEs基因[aac(3)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱ、aac(3)-Ⅲ、aac(3)-Ⅳ、aac(6')-Ⅰ b、aac(6')-Ⅱ、ant(3')-Ⅰ、ant(2')-Ⅰ和aph(3')-Ⅵ].结果 40株阴沟肠杆菌中,6种基因rmtB、aac(3)-Ⅱ、aac(6')-Ⅰ b、ant(3')-Ⅰ、ant(2')-Ⅰ和aph(3')-Ⅵ的阳性株数分别为5株(12.5%)、11株(27.5%)、29株(72.5%)、13株(32.5%)、2株(5.0%)和2株(5.0%);其余8种基因均阴性;AMEs基因总阳性率为85.0%(34/40).对29株aac(6')-Ⅰ b基因PCR阳性产物进行测序,证实有7株(24.1%)单独携带aac(6')-Ⅰ b-cr双功能酶基因(GenBank:EF375620、EU159121),18株(62.1%)单独携带aac(6')-Ⅰ b-Snzhou(苏州型,EU085533),3株(10.3%)同时携带aac(6')-Ⅰ b-Suzhou及aac(6')-Ⅰ b-cr 2种亚型,仅1株(3.4%)为aac(6')-Ⅰ b经典型.结论 临床分离的40株阴沟肠杆菌中16S rRNA甲基化酶基因阳性率较低而AMEs基因阳性率很高,至少存在5种AMEs基因.