乳腺癌术后长期存活及二年内复发者DNA含量分析

分析临床及病理资料相似的乳腺癌术后长期存活组（ｎ＝２０）和２年内复发组（ｎ＝２０）细胞核ＤＮＡ含量。结果：两组按临床分期，Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ期间的ＤＮＡ含量相差显著（Ｐ＜０．０５）；按病理组织学分级，各组间均有非常显著的差异（Ｐ＜０．０１）。２０对配对病例中，１４对ＤＮＡ含量相差显著，复发者明显高于存活者（Ｐ＜０．０５）；另６对无显著差异（Ｐ＞０．０５）。由此提示，在影响乳腺癌预后的诸因素中，ＤＮＡ含量为独立的标示预后的生物学因素；而正确选择术式和规范手术操作也是提高乳腺癌生存率的重要因素。     

激动型抗4-1BB抗体3H3交联促进CD8+T细胞中Akt激酶活性

目的:研究4-1BB信号促进CD8 T细胞增殖、存活及Akt活性的变化。方法:利用小鼠CD8α T细胞磁珠负性分选试剂盒制备高纯度CD8 T细胞,并通过体外抗CD3单克隆抗体(mAb)刺激活化CD8 T细胞。再通过流式细胞术(FCM)分析3H3交联与否,四唑盐(WST-1)/ECS检测CD8 T细胞的增殖程度,Annexin V检测抗凋亡能力,免疫印迹法分析胞内Akt磷酸化水平及Akt激酶活性。结果:3H3交联可以明显促进活化的CD8 T细胞增殖和存活,并且3H3介导的4-1BB信号可明显促进CD8 T细胞内Akt磷酸化水平及Akt激酶活性。结论:Akt途径可能参与了3H3交联介导的4-1BB信号对CD8 T细胞增殖与存活的调节效应。     

IFN-γ诱导人单核细胞MICs分子表达

目的：研究IFN-γ对MHC—I类链相关分子（MICs）表达的调节作用。方法：采用密度梯离离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC），以免疫磁珠法从PBMC中特异性分选单核细胞，以细胞因子IFN-γ、TNF-α或IFN—α刺激PBMC、纯化单核细胞或单核细胞系U937、THP-1后，以流式细胞术检测单核细胞表面MICs分子表达。结果：IFN-γ选择性上调人PBMC中单核细胞表面MICs表达；IFN-γ对人原代单核细胞及单核细胞系U937、THP-1细胞表面MICs分子表达均有诱导或上调作用，细胞因子TNF—α、IFN—α对单核细胞MICs分子表达无影响。IFN-γ诱导或上调表达的MICs分子不能被MICA或MICB特异性单克隆抗体（mAb）所识别，可能是一种新的MIC分子或MIC等位基因。结论：IFN-γ能诱导或上调人单核细胞表面MICs分子表达。     

慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTLs的KIR表达研究

目的检测慢性乙型肝炎患者外周血中HBV特异性CTL细胞表面杀伤细胞抑制性受体（KIR）的表达情况。方法利用MHC-Ⅰ-肽-五聚体（pentamer）技术结合流式三色分析技术,直接离体情况下检测（direct ex vivo）慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL细胞表面KIR的表达情况。结果在慢性乙型肝炎患者,KIR阳性的CD8^＋ T细胞明显增加;KIR阳性的HBcAg（18-27）特异性CTL、HBeAg（335-343）特异性CTL、HBp（575-583）特异性CTL的百分比分别为12％、20％、35％。结论慢性乙型肝炎患者不同HBV特异性CTL表达KIR,这可能与慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL功能低下密切相关。     

IL-15诱导CD4+CD25- T细胞向CD4+CD25+调节性T细胞转化的机制探讨

目的初步探讨IL-15诱导CD4+CD25-T细胞向CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)转化的机制。方法采用免疫磁性细胞分离法分离人外周血中的CD4+CD25-T细胞,依据加入细胞因子不同分为4组:对照组、IL-15组、拮抗1组、拮抗2组,其中后3组均于培养的第1天加入IL-15,而拮抗1组和拮抗2组分别于培养第1、3天加入STAT5a封闭性肽。流式细胞仪检测细胞表型变化,3H-TdR掺入法检测IL-15诱导产生的Tregs抑制CD4+CD25-效应T细胞(Teff)增殖的免疫功能,Western blot法检测细胞内p-STAT5的变化。结果与对照组比较,IL-15能诱导CD4+CD25-T细胞中CD25和Foxp3表达上调,IL-15诱导生成的Tregs具有较天然Tregs稍弱的免疫抑制功能。Western blot检测结果显示,IL-15组p-STAT5表达较对照组明显上调。加入STAT5a封闭性肽后,拮抗1组和拮抗2组中CD4+CD25-T细胞中CD25和Foxp3表达下调,但拮抗2组[细胞表型分别为(47.9±6.0)%、(20.7±3.4)%]改变较拮抗1组[细胞表型分别为(30.7±8....     

胸腺肽 α1 体外刺激胃癌患者外周血单个核细胞对淋巴细胞亚群影响

目的 观察胸腺肽α1(thymosin α1,Tα1)体外刺激培养胃癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)对淋巴细胞亚群分化及分泌细胞因子谱的影响,分析Tα1对肿瘤患者免疫功能的影响. 方法 分离32例胃癌患者及18例健康自愿者PBMCs,50、10、1 μg/ml Tα1体外刺激培养2 d;流式细胞仪检测CD4+、CD8+、CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞百分比、CD4+/CD8+变化及分泌Th1/Th2细胞因子谱变化. 结果 Tα1体外刺激PBMCs后,胃癌患者及健康自愿者的CD4+、CD8+ T细胞水平及CD4+/CD8+比值均无明显变化;健康自愿者CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞水平无明显变化,胃癌患者CD4+ CD25+ Foxp3+ T细胞水平明显提高(P<0.05);1 μg/ml Tα1促进胃癌患者PBMCs分泌IL-1β、TNF-α,10 μg/ml促进胃癌患者PBMCs分泌IL-6(P<0.05),健康自愿者PBMCs分泌细胞因子谱变化不明显(P>0.05). 结论 Tα1体外刺激胃癌患者PBMCs,提高CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg细胞亚群水平,可能对肿瘤患者抗肿瘤免疫起抑制效应.     

乙肝疫苗弱与无应答者外周血HBsAg抗原特异性CD4+CD25+调节性T细胞的体外诱导

目的 用乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)在体外刺激乙肝疫苗弱、无应答者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),看是否能够诱导出一群HBsAg特异性的CD4 CD25 调节性T细胞(CD4 CD25 regulatory T cell,简称Treg).方法 分离并培养乙肝疫苗强应答、弱应答和无应答者的外周血PBMCs,用植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)和HBsAg刺激,并设不加抗原的空白对照.流式细胞仪检测抗原刺激后Treg细胞的表达频率,并用噻唑蓝比色法(MTT)检测培养细胞的增殖反应.结果 弱、无应答组PBMC经HB8Ag刺激后Treg细胞的表达频率与PHA刺激孔和不加抗原的空白对照孔相比,明显上升(P＜0.01);而强应答组HBsAg,PHA刺激孔以及空白对照孔三孔之间Treg细胞的表达频率均无显著差异.MTT法检测细胞增殖反应,发现弱、无应答组与强应答组相比,HBsAg刺激后细胞增殖反应明显降低(P＜0.01),但三组之间PHA刺激孔以及空白对照孔均无显著差异.结论 乙肝疫苗弱、无应答现象可能是由于注射疫苗后,在体内诱导出了一群HBsAg特异性的Treg细胞,而这群具有抑制功能的T细胞介导了机体细胞及体液免疫功能的下降,从而导致弱、无应答现象的发生.     

乙肝病毒感染者外周血中CD4~+Foxp3~+T细胞亚群的表达及临床意义

目的研究外周血中3个CD4~+Foxp3~+T细胞亚群在乙肝病毒感染者外周血中频率及其可能的临床意义。方法分离来自无症状携带者(AsC)、慢性乙型肝炎患者(CHB)以及健康对照(Health)的外周血单个核细胞(PBMC),用流式细胞术分析PBMC中3个CD4~+Foxp3~+T细胞亚群占CD4~+T细胞的比例,并分析其与临床参数间的相关性,同时将CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg作对比分析。结果CD4~+CD45RA~+Foxp3~(lo)(静息态Treg)频率在各实验组间无显著差别;CD4~+CD45RA~-Foxp3~(lo)(非Treg)频率在CHB组和AsC组间无明显差别,但两组相对Health组明显升高;CHB组CD4~+CD45RA~-Foxp3~(hi)(活动态Treg)明显高于AsC组和Health组。在CHB和AsC病例中活动态Treg与HBV病毒载量,HBeAg状态均无显著相关性。在CHB病例中活动态Treg与ALT水平不相关。结论相当比例的不具抑制功能的Foxp3~+T细胞可能混杂在CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg的分析中,因此活动态Treg比CD4~+CD25~...     

核心蛋白聚糖对兔肌腱细胞增殖及细胞周期的影响

目的 观察核心蛋白聚糖(decorin,DCN)对兔肌腱细胞体外增殖和细胞周期的影响,以探讨decorin在肌腱愈合中对肌腱细胞的作用.方法 原代培养兔肌腱细胞,分别加入不同浓度(0.25、1.25、2.5、5μg/ml)的decorin;培养12、24、48 h用二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖速度;镜下观察低浓度DCN作用24 h后对兔肌腱细胞增殖的影响;低浓度DCN培养24 h后用流式细胞仪检测细胞周期.结果 0.25、1.25、2.5μg/ml浓度decorin作用12 h后对兔肌腱细胞增殖有着减少的趋势,但是24 h后却明显地促进其增殖(P＜0.05),但是48 h后差异不显著.而5μg/ml浓度组作品12 h对兔肌腱细胞增殖有着增加的趋势,24 h后促进增殖作用显著(P＜0.05),48 h后却抑制兔肌腱细胞的增殖.0.25μg/ml低浓度decorin作用兔肌腱细胞24h后镜下观察和流式细胞分析,细胞增殖明显增强,S期增加,PI明显大于对照组(P＜0.05).结论 低、中浓度decorin对兔肌腱细胞的增殖起着先延迟后促进的作用,提示在肌腱愈合中如果在肌腱和腱鞘之间运用DCN,可能起到早期隔离TGF-β对腱鞘成纤维细胞的作用,而后期增强TGF-β对腱内膜细胞的作用,从而促进内源性愈合,减少外源性愈合,达到减少粘连的效果.     

小鼠4-1BB特异性RNA干扰表达载体的构建及体外瞬时干扰效应的研究

目的 采用小片段RNA干扰(small interference RNA,siRNA)技术,通过构建系列小鼠4-1BB(m4-1BB)基因的特异性siRNA表达载体,体外观察对m4-1BB基因的瞬时沉默作用,筛选具有最佳干扰效果的siRNA表达载体.方法 设计并合成4条针对小鼠4-1BB全长特异性的siRNA寡核苷酸序列,插入真核表达载体(pENTRTM/U6 ),构建m4-1BB序列特异性siRNA 表达载体,根据靶位点分别命名为p336、394、498及763 siRNA,无关干扰质粒为pLacZ siRNA;通过体外m4-1BB真核表达质粒p4-1BB分别与各siRNA表达载体同时转染COS-7细胞,48h后通过RT-PCR和FACS(fluorescence-activated cell sorter,荧光活化细胞分选仪)观测COS-7细胞4-1BB mRNA及蛋白表达水平.结果经测序分析,各m4-1BB siRNA表达载体构建成功;其中p498 siRNA与p4-1BB双质粒转染COS-7 细胞,48h后可观察到细胞表面4-1BB分子明显下调,其胞内mRNA水平也显著降低,与无关干扰组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).其余siRNA载体,几乎无干扰效应,与无关干扰组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论我们所构建的p498 siRNA 真核表达载体,能明显干扰m4-1BB蛋白的瞬时表达,可望用于m4-1BB Lentivirus干扰表达系统的构建,进一步在小鼠原代T淋巴细胞内实现高效4-1BB表达沉默,以深入研究4-1BB对T淋巴细胞的生物学影响.