生物技术专业微生物学实验教学改革初探

生物技术专业是近年来医学院校新开设的一个专业，该专业的普通微生物学实验课教学与医学院校的医学微生物学实验课教学比较，在课程设置、教学内容、教学方法和教学手段等方面均有明显不同。对生物技术专业的普通微生物学实验课教学进行改革，逐步摆脱原医学微生物学实验课教学模式的束缚，建立适合生物技术专业的普通微生物学实验教学新模式，对培养适应现代生命科学技术发展需求、适应市场发展需要的生物技术创新人才，具有十分重要的现实意义。     

淋病奈瑟菌表面蛋白A真核表达载体的构建及表达

目的构建淋病奈瑟菌外膜蛋白———奈瑟菌表面蛋白A(neisseria surface protein A,NspA)的真核表达载体并使其在真核细胞中表达。方法用PCR方法扩增NspA基因,将扩增的产物连接于测序载体pUCm-T上,并构建重组体pcDNA3.1(+)/NspA。以脂质体法转染RAW264.7和COS-7细胞,用RT-PCR检测NspA mRNA的水平,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果扩增的目的基因包括了全段NspA基因,长度约525bp。以脂质体转染RAW264.7和COS-7细胞后,用RT-PCR和免疫组化染色法检测表明,细胞可转录和表达NspA。结论成功构建了重组真核表达载体pcD-NA3.1(+)/NspA,并在真核细胞中得到表达,为研究此蛋白的免疫原性以及淋病基因疫苗的研制提供了物质基础。     

人乳头瘤病毒16型E6蛋白真核表达载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的人乳头瘤病毒16型早期蛋白6真核表达载体pcDNA3．1（-），E6，为研究HPV16 E6蛋白在细胞永生化作用中的机制奠定实验基础。方法用聚合酶链反应（PCR）扩增E6基因。将PCR产物纯化后与pUCm-T载体连接，经蓝白斑筛选、双酶切鉴定及序列分析后，亚克隆至pcDNA3．1（-）真核表达载体中；阳性克隆经双酶切鉴定后转染RAW264．7巨噬细胞，Western blotting鉴定其在RAW264，7细胞中的表达。结果重组载体经酶切、PCR及测序证明插入片断序列正确无误，转染RAW264．7细胞后可在细胞中表达HPV16E6蛋白。结论成功构建的HPV16E6真核表达载体pcDNA3，1（-）／E6能在RAW264．7细胞中表达E6蛋白。     

幽门螺杆菌VacA N端真核表达载体的构建、鉴定及其诱导巨噬细胞空泡化和凋亡的观察

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)空泡毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)基因的真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/vacA,并在THP-1巨噬细胞中表达,为研究VacA单一毒力决定簇的致病性奠定实验基础。方法用Primer 5.0软件设计引物,以HP基因组为模板,PCR扩增vacA目的基因片段,克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR鉴定及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,荧光显微镜和Western-blot检测VacA蛋白在细胞中的表达;电镜观察巨噬细胞(MΦ)的空泡样变和凋亡;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果PCR扩增得到了大小约为1 428bp的目的片段,双酶切及测序鉴定证明成功构建了HP真核表达重组载体;转染后24h,重组质粒组部分细胞中有聚集的荧光颗粒,部分细胞发生空泡样变和凋亡改变;细胞凋亡率明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.001),细胞核因子-κB(nuclear factorkappaB,NF-κB)的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制细胞的凋亡。结论VacA蛋白瞬时高表达促进THP-1巨噬细胞空泡样变和凋亡。NF-κB可能参与调节VacA诱导的巨噬细胞凋亡。     

沙眼衣原体ompA真核表达重组体的构建及鉴定

目的 扩增D型沙眼衣原体ompA基因，构建真核表达重组质粒，为核酸疫苗的研制做准备。方法 用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段，重组入pUCm—T克隆载体。将pUCm—T／ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体，再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选，酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 从D型ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段，筛选出pUCm—T／ompA；经亚克隆，筛选鉴定出pcDNA3．1( )／ompA重组质粒。结论 成功地构建了pUCm—T／ompA重组质粒和pcLDNA3．1( )／ompA重组质粒，为Ct核酸疫苗的研制提供实验基础。     

人型枝原体对喹诺酮类药物的耐药性机理研究

为了解人型枝原体（Mh)对喹诺酮类药物的耐药机理,指导临床合理用药,采用肉汤稀释法测定了临床标本中100株Mh对9种喹诺酮类药物的敏感性,用PCR对交叉耐药Mh菌株旋转酶A亚单位（gyrA)的基因进行扩增,将扩增的DNA片段测序,结果,Y98-37,Y98-23,Y98-31,Y98-32同较大的抗Mh作用,0．25,2mg/L,OFLX与CPLX呈现耐药,MIC50为4mg/L,MIC90为8mg/L,NAL高度耐药,其MIC50与MIC90为128mg/L,选出3株对9种喹诺酮类药物呈交叉耐药Mh株,PCR扩增gryA生得到一大小为350bp的目的DNA,测序后将结果与标准敏感株MhPG21的gryA核苷酸序列进行比较,3株耐药株中均有113位碱基C→T的改变,使其其编码的83位氨基酸由丝氨酸变为亮氨酸,提示Mh gryA的113位C→T突变,可引起对喹诺酮类药物的交叉耐药。     

HPV16 E2蛋白及其TAD和DBD对巨噬细胞分泌TNF-α与IL-1β的影响

目的分析人乳头瘤病毒(HPV)16型E2蛋白及其转活性结构域(TAD)和DNA结合结构域(DBD)与绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白在巨噬细胞(MΦ)中的定位,并研究其对MΦ分泌TNF-α和IL-1β的影响。方法将质粒pEGFP-C1、pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD分别转染MΦ,倒置荧光显微镜下观察融合蛋白在MΦ中的分布与定位,通过ELISA测定转染细胞培养上清液中TNF-α和IL-1β的含量。结果 GFP、GFP-E2融合蛋白在MΦ细胞核、细胞浆内均有表达,且后者细胞核荧光亮度强于细胞浆;GFP-DBD融合蛋白表达于细胞核,GFP-TAD表达于细胞浆。GFP-E2组细胞培养上清中TNF-α和IL-1β含量分别为(321.83±22.00)pg/ml和(214.35±22.79)pg/ml,GFP-TAD组分别为(371.79±22.73)pg/ml和(233.52±17.75)pg/ml,GFP组和空白组分别为(265.74±28.74)pg/ml、167.60±18.68)pg/ml和(234.76±31.94)pg/ml、155.13±20.54l)pg/ml,差异有统计学意义(P<0.05);GFP-DBD组分别为(258.24±33.55)pg/ml和(148.08±19.50)pg/ml,与GFP组和空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。GFP-TAD组与GFP-E2组比较TNF-α含量差异有统计学意义(P<0.05),IL-1β含量差异无统计学意义(P>0.05)。结论真核表达载体pEGFP-C1/HPV16E2、pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD均能在MΦ中表达相应的融合蛋白,GFP-E2主要定位细胞核,GFP-DBD仅定位细胞核,GFP-TAD仅定位细胞浆;HPV16E2及其TAD即时高表达上调MΦ分泌TNF-α和IL-1β。     

运动对慢性疲劳综合征小鼠免疫功能影响

慢性疲劳综合征(chron ic fatigue syndrom e,CFS)是一种疲劳性疾病⁽¹⁾。适量运动能增强机体免疫功能,有效刺激淋巴细胞、臣噬细胞的增殖,促进免疫细胞因子的释放,增强自然杀伤(NK)细胞、淋巴因子-激活的杀伤(LAK)细胞等杀伤细胞的杀伤活性⁽²⁾。大强度的运动训练可降低巨噬细胞分泌免疫细胞因子的能力,降低机体免疫力⁽³⁾。本文通过建立CFS小鼠模型,观察运动对CFS小鼠脾脏指数以及脾脏NK细胞活性、淋巴细胞增殖率、白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)含量的影响,探讨运动对抗疲劳的免疫作用。     

生殖支原体脂质相关膜蛋白通过c-Src/ROS/Nrf2途径

目的 探讨生殖支原体脂质相关膜蛋白（LAMPs）诱导胎盘滋养层细胞表达血红素氧合酶-1（HO-1）的分子机制。 方法 用0.5～5 μg/mL生殖支原体LAMPs处理体外培养的胎盘滋养层细胞4～12 h,采用实时定量PCR和Western blot法分别检测HO-1 mRNA和蛋白的表达以及核因子相关因子-2（Nrf2）的核转位;比色法观察HO-1的酶活性;2′,7′-二氯二氢荧光黄二乙酸酯（H₂DCFDA）检测活性氧产生。分别采用酪氨酸激酶c-Src抑制剂PP1、活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）和Nrf2 siRNA干预,观察HO-1的表达情况。 结果 生殖支原体LAMPs能诱导滋养层细胞HO-1 mRNA和蛋白的表达,上调其酶活性。同时,LAMPs也能诱导其产生活性氧,并促使Nrf2核转位。PP1和NAC预处理后,可明显降低HO-1的表达水平以及细胞核内Nrf2含量。采用Nrf2 siRNA转染后,HO-1的表达显著减少。 结论 生殖支原体LAMPs通过c-Src/ROS/Nrf2途径诱导滋养层细胞表达HO-1。     

生殖支原体脂质相关膜蛋白诱导胎盘滋养层细胞表达血红素氧合酶1从而负调控细胞因子分泌

目的观察生殖支原体脂质相关膜蛋白(LAMP)能否诱导胎盘滋养层细胞表达血红素氧合酶1(HO-1),从而影响细胞因子的产生。方法体外培养胎盘滋养层细胞,用0.5~5μg/m L LAMP作用4~12 h。实时定量PCR和Western blot法分别检测HO-1 mRNA和蛋白的表达以及核因子相关因子2(Nrf2)的核转位;2',7'-二氯二氢荧光黄二乙酸酯(H2DCFDA)检测活性氧(ROS)产生;采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)或Nrf2 siRNA处理滋养层细胞,观察其对HO-1表达的影响。采用HO-1的激动剂钴原卟啉(Co PP),抑制剂锌原卟啉(Zn PP)或HO-1 siRNA处理细胞,ELISA检测处理前后LAMP对诱导肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)分泌的影响。结果 LAMP能诱导滋养层细胞HO-1 mRNA和蛋白表达,并能诱导其产生ROS以及促进Nrf2核转位。ROS抑制剂NAC预处理后,可明显降低HO-1的表达水平以及细胞核内Nrf2含量。同时,Nrf2siRNA转染后,HO-1表达显著减少。采用Zn PP处理滋养层细胞,或RNA干扰HO-1表达后,可促进LAMP诱导滋养层细胞分泌TNF-α和IL-1β,而Co PP处理能进一步降低TNF-α和IL-1β水平。结论 LAMP能通过ROS/Nrf2诱导滋养层细胞表达HO-1,从而抑制细胞因子的过度分泌。