人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

人巨细胞病毒IE1真核表达载体的构建与表达

目的构建人巨细胞病毒（HCMV）IEl真核表达载体，观察其在真核细胞内的表达，为HC—MVIEl核酸疫苗的相关研究奠定基础。方法将质粒pNEBl93-IEl用Sal I、BamH I双酶切与载体pEGFP—C1连接构建重组载体pEGFP—C1-IEl；双酶切鉴定后，取重组载体pEGFP—C1-IEl用EcoR I 、Hind Ⅲ／双酶切与载体pcDNA3．1（-）连接构建重组质粒pcDNA3．I（-）-IEl，双酶切和测序鉴定；将重组质粒pcDNA3．1（-）-IEl转染HeLa细胞，RT—PCR检测IElmRNA的表达。结果重组载体pEGFP—C1-IEl和pcDNA3．1（-）-IEl双酶切后均可切出约1476bp目的片段；重组载体pcDNA3．1（-）-IEI测序结果登录C,enBank，作BLAST分析，含有1476bp目的基因片段，无碱基错配和移码突变，与读码框完全-致；转染重组载体pcDNA3．1（-）-IEl的细胞中可扩增出约1476bp的目的条带。结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-IEl，且其能在真核细胞内袁达。     

不同培养时间与培养基pH值对体外实验中喹诺酮类抗解脲脲支原体药物敏感性的影响

目的研究不同培养时间及培养基pH值对左氧氟沙星、司帕沙星及加替沙星在体外抗解脲脲支原体（Uu）MIC的影响。方法用微量液体倍比稀释法,测定了35株临床Uu对3种药物在pH值6.0、6.5、7.0的培养基中,分别培养24、36、48、60 h时的MIC并统计分析。结果60 h的MIC与48 h相同,pH值〉6.5时,Uu对加替沙星100.0%敏感;司帕沙星耐药率较高;在不同pH值时,培养时间由24 h延长到36 h及48 h,左氧氟沙星、司帕沙星及加替沙星的MIC分别可增加1-32、1-8及1-16倍（各组P〈0.05）,耐药率也逐渐升高;pH值由6.0升高到6.5及7.0时,在不同培养时间,司帕沙星及加替沙星的MIC均可降低1-8倍（各组P〈0.05）,耐药率均逐渐降低;而左氧氟沙星的MIC50、MIC90及耐药率均升高。结论体外实验中,司帕沙星及加替沙星的MIC随培养时间延长而升高,随培养基pH值升高而降低;左氧氟沙星的MIC随培养时间延长及pH值升高而升高;加替沙星有良好的抗Uu活性;培养48 h可以作为测定MIC的终点时间。     

Effect of HCMV IE1 Protein on Cytokines Secretion and Apoptosis of Macrophages

Objective： To investigate the effect of human cytomegalovirus （HCMV） IE1 protein on the secretory activity and apoptosis of macrophages. Methods： The eukaryotic expression vector pEGFP-C1/IE1 was used to transfect THP-1-macrophages. 48 h after transfection, the expression and localization of GFP or GFP-IE1 was observed under fluorescent microscope. The levels of IL-1β and TNF-α in the culture media were examined by ELISA, and the mRNA expression of them was analyzed by RT-PCR. Cell undergoing apoptosis were determined by flow cytometry using the propidium iodide （PI） staining method. The data were analyzed by SPSSI3.0. Results： As observed under fluorescent microscope, the expressions of GFP-IEI and GFP by plasmid pEGFP-C1/IE1 or pEGFP-C1 in THP-1-macrophages could be found in nuclei or whole cells. Conclusion： As demonstrated by RT-PCR and ELISA, mRNA and protein expressions of IL-1β and TNF-α and promotes apoptosis in THP-1-macrophages.     

B 群脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白NMB0315 核酸疫苗的免疫活性和免疫保护作用初步研究

目的:构建B群脑膜炎奈瑟菌pc DNA3.1(+)/NMB0315真核表达重组质粒,检测其诱导小鼠产生的特异性体液免疫和细胞免疫应答水平、免疫血清体外杀菌效果及免疫保护作用,初步探讨NMB0315核酸疫苗的免疫活性和免疫保护效果,为研制一种新的预防B群流脑的核酸疫苗提供实验依据。方法:以B群脑膜炎奈瑟菌标准株MC58基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增NMB0315基因,克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体中,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切及测序鉴定重组质粒。构建成功的pc DNA3.1(+)/NMB0315重组质粒转染COS-7细胞和RAW264.7细胞,免疫细胞化学染色法和Western blot法检测重组蛋白在真核细胞中的表达。大量提取重组质粒,肌注免疫BALB/c小鼠,检测小鼠体内抗NMB0315的特异性体液免疫和细胞免疫水平;测定免疫血清体外杀菌滴度,观察核酸疫苗对实验小鼠的免疫保护效果。结果:构建的核酸疫苗pc DNA3.1(+)/NMB0315能够在真核细胞中有效转录和表达;免疫小鼠后能诱导产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答。在疫苗免疫后的2、4、6周,pc DNA3.1(+)/NMB0315组和pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G组血清总Ig G及Ig G1、Ig G2a、Ig G2b和Ig G3亚类抗体水平呈递增趋势,均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P0.001);小鼠血清Ig G2a/Ig G1比值均小于1;生殖道灌洗液中特异性s Ig A水平均明显高于PBS、pc DNA3.1(+)、Cp G对照组(P0.01)。免疫第6周,脾淋巴细胞刺激指数(SI)均明显高于对照组(P0.01,P0.01,P0.05)。pc DNA3.1(+)/NMB0315+Cp G、pc DNA3.1(+)/NMB0315疫苗组免疫血清补体介导的体外杀菌效价分别为1∶128和1∶64;在致死量B群脑膜炎奈瑟菌MC58攻击后72 h存活率分别为70%和65%,对照组[PBS,pc DNA3.1(+),Cp G]72 h存活率为0。结论:NMB0315核酸疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫(包括黏膜免疫)和细胞免疫应答;免疫血清补体介导的体外杀菌活性较高;NMB0315核酸疫苗对感染B群脑膜炎奈瑟菌小鼠具有较强的免疫保护作用。     

淋球菌对7种抗菌药物敏感性的测定

目的 了解江门地区淋球菌流行株对抗生素的敏感性，为淋病的防治提供试验依据。方法 采用琼脂稀释法对95株淋球菌临床分离株进行了药物敏感性测定。结果 在测定的7种抗生素中，对淋球菌敏感性较高的5种抗生素依次为阿奇霉素、罗红霉素、红霉素、头孢曲松和壮观霉素，其敏感率分别为100．0％、98．9％、98．9％、95．8％和94．7％。而淋球菌耐药性较高的2种抗生素依次为交沙霉素和头孢唑啉钠，耐药率均为8．4％。结论 阿奇霉素、头孢曲松和壮观霉素仍可作为江门地区淋病治疗的首选药物，但淋球菌对头孢曲松和壮观霉素已出现耐药株，应引起临床医师的高度警惕；罗红霉素、红霉素可作为江门地区淋病治疗的替代性药物。     

不育患者解脲支原体和沙眼衣原体感染的研究

应用分离培养法和质粒ＰＣＲ法分别对３７５例不育患者（不育组）及２３１例正常生育者（对照组）进行解脲支原体（Ｕｕ）和沙眼衣原体（Ｃｔ）的检测，不育组Ｕｕ的检出率为５２．３％，Ｃｔ检出率为２８．８％，对照组各为１５．２％和１０．０％，两组有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。在不育组中，Ｕｕ或Ｃｔ单一感染和Ｕｕ、Ｃｔ混合感染分别为３７．９％、１４．４％和１４．４％；对照组分别为１０．４％、５．２％和４．８％。两组相比，均有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。应用代谢抑制试验（ＭＩＴ）对Ｕｕ进行分型研究，不育组以Ｕｕ４型感染居多（２６．７％），对照组则以Ｕｕ３型最为常见（２８．６％）。     

粘膜佐剂LTB优化的抗淋病ltB-nspA融合基因疫苗鼻饲免疫效果研究

目的:用真核重组质粒pcDNA3.1(-)/ltB-nspA鼻饲免疫小鼠,探索粘膜佐剂LTB辅佐NspA所诱发的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答水平。方法:对真核重组质粒行PCR及双酶切鉴定后大量制备,经鼻饲途径免疫雌性BALB/c小鼠,间接ELISA法检测血清中NspA特异性IgG抗体水平及小鼠生殖道灌洗液中NspA特异性sIgA抗体水平;MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平,ELISA双抗体夹心法检测脾淋巴细胞培养上清IFN-γ含量。结果:融合基因pcDNA3.1(-)/ltB-nspA组小鼠生殖道灌洗液中sIgA(A450:0.316±0.045)明显高于pcDNA3.1(-)/nspA单基因组(P0.05)和其它对照组(P0.01);小鼠血清中IgG(A450:0.643±0.156)水平、脾淋巴细胞刺激指数(SI:1.65±0.32)和脾淋巴细胞诱生的IFN-γ(160.56±25.67pg/ml)水平均明显高于pcDNA3.1(-)/ltB、空质粒pcDNA3.1(-)和PBS对照组(P0.01)。结论:pcDNA3.1(-)/ltB-nspA融合基因疫苗经鼻饲免疫,能够诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答;粘膜佐剂LTB可辅佐NspA诱导小鼠产生更高水平的生殖道粘膜免疫。     

人型支原体对五种大环内酯类药物敏感性研究

目的检测人型支原体（Mh）对14环（红霉素、罗红霉素和克拉霉素）、15环（阿奇霉素）和16环（交沙霉素）大环内酯类药物的敏感性，为临床合理用药提供参考依据。方法采用微量肉汤稀释法检测了5种大环内酯类药物对106株Mh的最低抑菌浓度（MIC）。结果在5种药物中，交沙霉素抗Mh活性最强，MIC50为0、125mg/L，MIC90为0．5mg／L，较弱的为罗红霉素、克拉霉素和阿奇霉素，其MIC50分别为4mg／L、32mg／L和64mg/L，MIC90分别为32mg／L、128mg／L和512mg／L，最弱的为红霉素，MIC50为64mg／L，MIC。为512mg／L，结论Mh对大环内酯类药物存在不同程度的耐药，16环大环内酯类药物交沙霉素，抗Mh活性强于14环和15环大环内酯类药物。     

126例沙眼衣原体感染男性非淋菌性尿道炎的临床分析

用快速免疫法、PCR和培养法对126例沙眼衣原体（Ct）阳性男性非淋菌性尿道炎（NGU）患者进行合并感染和临床治疗研究。结果显示：126例Ct阳性NGU患者，合并感染共78例（57．14％），其中单一合并Uu28例（22．22％）、Cd8例（6．34％）、Tv11例（8．73％）、Mh7例（5．55％）、Gc14例（11．1％），同时合并Uu＋Mh4例（3．17％）、Cd＋TV12例（9．52％）。在103例Ct阳性NGU患者，采用阿奇红霉素1g，加服强力霉素0．g，2次／d，与美满霉素0．1g1次／d，加服利福平0．6g2次／d，两种方法总治愈率为73．67％，两者比较差异无显著性意义（P＞0．05）。本研究结果为Ct阳性男性NGU患者的诊断与治疗提供了实验依据。