Daxx与PML在HeLa和Caski细胞株中的定位观察

目的 分析宫颈癌细胞内早幼粒细胞白血病蛋白(PML)和死亡域相关蛋白(Daxx)的定位,为进一步研究高危型HPV16和HPV18的致癌机制奠定试验基础.方法 培养HeLa细胞和Caski细胞,利用间接免疫荧光试验,在激光共聚焦显微镜下观察并分析PML和Daxx在细胞内的定位;分析Caski细胞中Daxx与HPV16 E6蛋白定位.结果在HeLa细胞和Caski细胞,PML红色信号和Daxx绿色信号在胞核和胞浆呈弥散样均匀分布;Daxx绿色信号与PML红色信号重叠时,依然显示各自的绿色信号与红色信号.在Caski细胞,HPV16 E6和Daxx在细胞中分布不均匀,呈区域性聚集;表达红色信号的HPV16 E6与表达绿色信号的Daxx重叠成黄色信号.结论 在Caski细胞和HeLa细胞,PML定位于细胞核的PML-NBs;Daxx在胞核和胞浆呈弥散样均匀分布;两者未发生共定位.Daxx与HPV16 E6蛋白在Caski细胞共定位于胞浆与胞核.     

幽门螺杆菌VacA N端片段通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡

目的:本研究初步探讨幽门螺杆菌(H.pylori)空泡毒素单一毒力决定簇对GES-1胃黏膜上皮细胞凋亡的影响,为进一步研究H.pylori的致病机制奠定基础。方法:将本课题组已构建的pDsRed-Monomer-C1/VacA N端真核表达载体转染至GES-1细胞中,Western blot鉴定VacA蛋白在细胞中的表达;电子显微镜和中性红摄取试验检测GES-1细胞的空泡样变;Hoechst33342染色、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒以及电镜观察细胞凋亡情况,同时采用分光光度法检测细胞Caspase-9、Caspase-3的活化程度,Rho123检测细胞跨膜电位的变化,ELISA法检测细胞色素C的释放。结果:重组质粒pDsRed-Monomer-C1/VacA转染GES-1细胞24小时后,电镜下可明显观察到空泡样变及核固缩、染色质边聚等凋亡特征,重组质粒组部分细胞发生空泡样变;Hoechst 33342染色后镜下可见明显的核染色质浓缩,Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测发现重组质粒组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05);Caspase-9和Caspase-3活化程度呈时间依赖性增加,分别在12小时和24小时达到峰值;Rho123染色发现线粒体跨膜电位明显降低;重组质粒转染组释放细胞色素C的浓度呈时间依赖性正相关,与空质粒组及对照组相比差异显著(P<0.05)。结论:VacA N端片段可诱导GES-1细胞凋亡及空泡样变,VacA蛋白可激活Caspase-9和Caspase-3,且可能主要通过线粒体途径诱导GES-1细胞凋亡。     

淋病奈瑟球菌表面蛋白A基因疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

目的构建淋病奈瑟球菌表面蛋白A（NspA）基因疫苗，并接种小鼠，评价其诱导的体液和细胞免疫应答。方法将NspA基因插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／NspA，并经PCR、双酶切及测序鉴定。反转录一聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学法分别检测NspA基因转染细胞后mRNA和蛋白的表达。以pcDNA3．1（＋）／NspA重组质粒免疫45只雄性BALB／c小鼠，试管凝集法检测免疫小鼠抗体滴度，ELISA检测IFN-γ水平，四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测脾淋巴细胞增殖。提取接种部位股四头肌总DNA，PCR检测BALB／c小鼠肌细胞内NspA基因。结果成功构建pcDNA3．1（＋）／NspA基因疫苗，能在真核细胞中转录和表达。pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组的抗体滴度达1：640，pcDNA3．1（＋）和PBS免疫组均无特异性抗体检出。空载体pcDNA3．1（＋）组IFN-γ为（23．79±11．85）pg／mL，pcDNA3．1（＋）／NspA免疫组为（169．71±30．52）pg／mL（P〈0．01）；脾淋巴细胞增殖的刺激指数（SI）分别为1．05±0．30和1．94±0．74（P〈0．01）。并证实NspA基因可在小鼠肌细胞中稳定存在。结论构建淋病奈瑟球菌NspA基因疫苗，将其免疫BALB／c小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫应答，为进一步用于淋病预防奠定了基础。     

GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位

目的 研究GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.方法 PCR扩增HPV16E5基因片段,将其连接到真核表达截体pEGFP-C1,双酶切及测序鉴定,构建表达截体pEGFP-C1/HPV16 E5;将质粒pEGFP-C1/HPV16 E5和pEGFP-C1分别转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下现察GFP-HPV16 E5融合蛋白在HeLa细胞内的表达与定位.结果 GFP 荧光均匀分布在细胞浆和细胞核;GFP-HPV16 E5融合蛋白组荧光分布在细胞浆.结论 GFP-HPV16 E5融合蛋白能在HeLa细胞内表达且定位于细胞浆.     

黏膜佐剂大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位优化的淋病奈瑟菌孔洞蛋白B核酸疫苗的构建及其诱导小鼠的免疫应答

Objective To investigate the specific humoral immune response and cellular immune response induced by DNA vaccine with Neisseria gonorrhoeae porin B (PorB) fused with B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin B (LTB) in mice. Methods Target genes of porB, ltB and ltB-porB were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into eukaryotic vector pcDNA3.1(-). The recombinants were identified by PCR, enzyme digestion and DNA sequencing.The vectors were transfected into Hela cells, and expressed proteins were checked by cytoimmunofluorescence. Female BALB/c mice were intranasally immunized with recombination vectors. The humoral immune response and cellular immune response were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) colorimetric assay. The expressions of recombination vectors in intranasal mucosal tissues of the immunized mice were detected by immunohistochemistry. The means between groups were compared by analysis of variance. Results All the three recombinants were expressed in Hela cells and intranasal mucosal tissues. The PorB specific IgG in serum and sIgA in vaginal secretions in DNA vaccine immunized mice were significantly higher than those in controls (P＜0.01 ; P＜0.05). Moreover, the sIgA level in pcDNA3.1 (-)/ltB-porB group was higher than that in peDNA3, 1(-)/porB group (P＝0. 002). The levels of interferon-gamma (IFN-γ) and interleukin-4 (IL-4) in the supernatants and stimulation index (SI) of spleen lymphocyte culture in pcDNA3, 1(-)/porB group were (170.04±23.89) pg/mL, (114.68±14.27) pg/mL and 1. 68±0.19, respectively; and those in pcDNA3, 1(-)/ltB-porB group were (161.42±27.50) pg/mL, (124.16±19.04) pg/mL and 1.73±0.28, respectively; which were both higher than those in pcDNA3.1(-)/ phosphate buffered saliae (PBS) group (P＜0. 01; P＜0.05) and pcDNA3.1 (-)/ltB group (all P＜0.05), while there was no significant difference between pcDNA3.1 (-)/ltB-porB group and pcDNA3. 1 (-)/porB group (0. 998, 0. 696, 0. 994; all P＞0.05). Conclusions The constructed DNA vaccines are all successfully expressed in Hela cells and murine intranasal mucosal tissues. The mucosal immunization of the vaccines [pcDNA3. 1 (- )/porB and pcDNA3.1 ( -)/ltBporB] could induce humoral immune response and cellular immune response, especially mucosal immune response. It is confirmed that mucosal adjuvant LTB could promote PorB to induce higher level of mucosal immune response in mice.     

半巢式聚合酶链反应扩增全血中梅毒螺旋体polA基因

目的探讨半巢式聚合酶链反应（PCR）扩增梅毒螺旋体（Tp）的DNA多聚酶Ⅰ基因（polA）以探讨检测全血标本中微量Tp的可行性。方法应用半巢式PCR和常规PCR分别扩增165例可疑梅毒及非梅毒患者全血中Tp的polA,与血清学方法比较,探讨半巢式PCR方法在扩增全血中Tp DNA的意义。结果待测的165例标本中,与血清学方法比较,半巢式PCR检测Tp的敏感性和特异性分别为62.7%和95.9%,两者符合率为82.4%;两种PCR方法检测结果差异有显著性（P〈0.01）,半巢式PCR敏感性远高于常规PCR。结论半巢式polA PCR检测全血中Tp较常规PCR灵敏,是血清学方法诊断梅毒的有效补充,但其检测的灵敏度仍有待进一步提高。     

hDaXX与12型腺病毒E1B55KD癌蛋白在体内外的结合反应

目的：研究12型糖尿病(Adenovirus 12,Ad12)E1B 55KD癌蛋白（Ad12E1B 55KD）打破hDaxx与急性早幼粒细胞性白血病蛋白（promyelocytic leukemia protein,PML）在细胞核共定位的机制。方法：构建hDaxx原核细胞表达质粒pQE30/hDaxx，并在大肠杆菌（E.coli）BL21中诱导表达，用镍-氮基三乙酸（Ni-NTA）琼脂糖加以纯化。通过体内外共免疫沉淀反应，Western blot方法研究hDaxx与Ad12E1B55KD直接结合反应。结果：质粒qQE30/hDaxx在E.coli BL21中成功诱导表达了hDaxx,其N端有6个组氨酸分子附着（6His-hDaxx）.Wetern blot结果显示hDaxx在体内外与Ad12E1B 55KD发生直接结合反应。结论：表达并获得纯化的6His-hDaxx,hDaxx能在体内外与Ad12E1B55KD直接结合。     

衡阳地区淋球菌流行株对抗生素耐药性监测

目的了解衡阳地区淋球菌流行株对抗生素的耐药性及产青霉素酶淋球菌(PPNG)和高水平耐四环素淋球菌(TRNG)的流行状况.方法采用琼脂稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)以及用改良碘法检测β-内酰胺酶.结果101株淋球菌共检出PPNG 32株(31.7%)、TRNG 20株(19.8%),对四环素、环丙沙星、青霉素及大观霉素的耐药率分别为94.1%、91.1%、89.1%和2.0%,未发现耐头孢曲松钠的菌株.淋球菌交叉耐药情况较为严重,79.2%菌株对青霉素和环丙沙星呈现交叉耐药,84.2%菌株对四环素和环丙沙星呈现交叉耐药.结论头孢曲松钠和大观霉素仍可作为衡阳地区淋病治疗的首选药物,但大观霉素已出现耐药株,应引起临床医师的高度警惕;持续监测淋球菌的耐药性十分重要.     

利用膜蛋白酵母双杂交系统构建人尿道上皮细胞cDNA文库

利用基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交技术,构建人永生尿道上皮细胞(SV-HUC-1)cDNA文库。Trizol法提取人尿道上皮细胞总RNA,并分离纯化其mRNA;以mRNA为模板,合成cDNA第一链、第二链;通过T4 DNA聚合酶将DNA链两端加上5′接头;并将其大于1 kbp的片段与膜蛋白酵母双杂交载体pPR3-N连接,经电转化大肠杆菌感受态细胞,以构建基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,并检测文库的库容量和随机性。本研究成功构建了人尿道上皮细胞的基于分离的泛素介导的膜蛋白酵母双杂交cDNA文库,为进一步研究泌尿生殖道感染病原体与宿主尿道上皮细胞的相互作用奠定了实验基础。     

pEGFP/MOMP真核表达重组体的构建及表达

目的：克隆沙眼衣原体主要外膜蛋白(MOMP)基因，构建pEGFP／MOMP真核表达重组质粒，为沙眼衣原体核酸疫苗的研制提供依据．方法：用PCR方法从D型Ct基因组中扩增MOMP全基因片段，克隆人真核表达载体pEGFP相应的酶切位点中，阳性重组子经BanH I、Kpn I双酶切、PCR扩增及测序鉴定；并经脂质体介导转染HeLa细胞，36h后观察瞬时表达情况。结果：PCR扩增得到约1．2kb的特异性MOMP基因片段；序列测定证实与GenBank卺录的D型沙眼衣原体一致；筛选鉴定出真核表达重组体pEGFP／MOMP。结论：成功地构建了pEGFP／MOMP真核表达重组体，并在HeLa细胞中表达了MOMP。