人TNFα－EGF重组质粒的构建

本实验将编码人ＴＮＦａ分子上与其受体相关的部分核苷酸序列缺失，代之以人ＥＧＦ基因ｃＤＮＡ，实现基因重组。转化子经快速细胞破碎法初筛、经Ｄｏｔｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ鉴定，从中挑选出２０个人ＴＮＦａ－ＥＧＦ阳性重组质粒，为进一步获得重组嵌合人ＴＮＦａ－ＥＧＦ分子和ＴＮＦａ作用机制的深入探讨奠定了初步基础。     

反义bcl—2寡脱氧核苷酸对U937细胞增殖和存活能力的影响

本实验观察了与人类ｂｃｌ－２ ｍＲＮＡ翻译起始部位相互补的硫代反义ｂｃｌ－２寡脱氧核苷酸（ＡＳ－ｏＯＤＮ）对Ｕ９３７细胞增殖和存活能力的影响，结果表明：一定浓度的ＡＳ－ｓＯＤＮ可明显抑制细胞Ｂｃｌ－２蛋白的表达，但对细胞增殖和存活能力无明显影响。这一研究结果为在不同表达ｂｃｌ－２的肿瘤细胞中探讨ｂｃｌ－２反义核酸作用的普遍性和正确评价其作用地位积累了资料。     

人TRAIL分子胞外区的纯化及活性检测

目的：利用大肠杆菌表达hTRAIL41-281蛋白，并纯化复性成生物活性形式。方法：以IPTG诱导表达，使用Ni-NTA层析柱分离纯化蛋白，透析法复性，SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定，DNA断裂实验检测hTRAIL41-281蛋白的凋亡诱导活性。结果：表达的蛋白以包涵体的形式存在，纯化后得到分子量为30.5kD、纯度在90％以上的蛋白，Western blot证实为hTRARIL41-281分子。经复性，DNA断裂实验检测出该蛋白有较好的诱导肿瘤细胞凋亡活性。结论：成功地利用大肠杆菌表达、Ni—NTA层析柱分离纯化、透析法复性hTRAIL41-281蛋白，并证实其具有诱导肿瘤细胞凋亡的生物学活性。     

人源性胃癌抗体IgG1Fab噬菌体表面展示文库的构建

目的　利用噬菌体表面展示技术 ,构建人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .方法　从胃癌手术患者胃一级站淋巴结中提取总 RNA,反转录成 c DNA后 ,用PCR扩增人 Ig G1Fd段及κ轻链 ,并克隆至噬菌粒载体p COMB3中 ,转化宿主菌株 XL 1- Blue,以辅助噬菌体M13K0 7超感染噬菌粒文库 ,构建成人源性胃癌抗体 Ig G1Fab噬菌体表面展示文库 .结果　得到一个含克隆数为 1.2× 10 6 ,实际滴度约为 2 .5 6× 10 1 5 pfu· L- 1的 Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库 .结论　Ig G1Fab片段的噬菌体表面展示文库的成功构建 ,为下一步利用亲和富集筛选技术 ,获得具有胃癌表面抗原结合活性的融合抗体及可溶性抗体奠定了基础     

甘氨酸/丝氨酸置换146位半胱氨酸对sBAFF功能的影响

目的探讨甘氨酸/丝氨酸置换146位半胱氨酸对sBAFF功能的影响,为深入探讨sBAFF的功能和机制奠定基础.方法采用一步反向PCR法,将编码sBAFF第146位半胱氨酸(Cys)的核苷酸序列置换为甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的编码序列,测序正确后,亚克隆到高效原核表达载体pQE-80L;以IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,Ni2 -NTA柱层析纯化目的蛋白;最后经MTT法检测其促B淋巴细胞增殖活性.结果经一步反向PCR扩增后均得到459 bp的DNA片段,经测序分析表明分别为sBAFF 第146位半胱氨酸残基点突变为甘氨酸和丝氨酸的序列,目的蛋白在大肠杆菌中得到高效表达.活性检测证实其能明显刺激B淋巴细胞系Raji细胞增殖,与正常sBAFF相比,置换为丝氨酸后活性升高,置换为甘氨酸后活性无明显改变.结论在原核表达时,通过置换146位半胱氨酸为丝氨酸可明显提高sBAFF的活性,为进一步探讨sBAFF的功能机制奠定了基础.     

创伤死亡不同血糖水平患者存活时间、感染率和MODS发生率病历调查

目的研究创伤死亡不同血糖水平患者院前创伤评分(revised trauma score,RTC;glasgow coma scale,GCS)、3 d后死亡构成比、感染率和多器官功能不全综合征(multipe organ dysfunction syndrome,MODS)发生率的变化.方法随机抽查本院1999年1月至2005年1月455份住院创伤死亡病历,根据空腹血糖水平及正常参考范围分为创伤死亡正常血糖组57例和创伤死亡高血糖组298例.统计创伤死亡不同血糖水平组RTC、GCS、3 d后死亡构成比、感染率和MODS发生率及的变化,并计算创伤死亡患者血糖与MODS相关定量指标的相关系数.结果①创伤死亡高血糖组RTC为6.31±1.04,GCS为4.23±0.52;创伤死亡正常血糖组RTC为4.43±0.22,GCS为2.21±0.34.创伤死亡高血糖组院前创伤评分明显高于创伤死亡组正常血糖(P＜0.01).②创伤死亡高血糖组3 d后死亡构成比为67.34%,创伤死亡正常血糖组3 d后死亡构成比为17.54%.创伤死亡高血糖组3 d后死亡构成比明显高于创伤死亡正常血糖组(P＜0.01).③创伤死亡高血糖组感染率为83.92%,MODS发生率为71.86%;创伤死亡正常血糖组感染率为21.05%,MODS发生率为10.53%.创伤死亡高血糖组感染率和MODS发生率均明显高于创伤死亡正常血糖组(P＜0.01).④455例创伤死亡患者血糖水平与血ALT、AST、BUN、CRE、PCO2、CK明显正相关(P值均＜0.01).结论创伤死亡高血糖患者院内存活时间长,感染率和MODS发生率高.创伤死亡正常血糖患者伤情重,存活时间短,感染率和MODS发生率低.创伤高血糖患者死亡因素以感染和MODS为主,创伤正常血糖患者死亡因素以非MODS因素(大出血和颅脑直接损伤等)为主.创伤血糖水平升高可作为创伤MODS预警指标,但血糖正常预后也不一定好.     

重组人BAFF112-285的制备及活性分析

目的 制备具有功能活性的重组人TNF家族的B细胞激活因子(B cell activating factor belonging to the TNF family,BAFF)胞外区112—285氨基酸残基段(rhBAFF112—285)，为BAFF的深人研究奠定基础。方法 提取人HL-60细胞总RNA，经RT—PCR扩增编码人BAFF胞外区112—285氨基酸残基(BAFF112—285)的cDNA，行序列测定后，构建于原核表达载体pQE—80L并转化大肠杆菌DH5α，经IPTG诱导表达rhBAFF112—285，Ni^2 —NTA层析纯化，进而经^3H—TdR掺人实验检测其免疫学活性。结果 RT—PC双扩增得到了525bp的DNA片段，序列分析与GenBank中报道的编码人BAFF112—285的cDNA序列一致，该胞外区片段在大肠杆菌中获得了高效表达，表达水平达细菌总蛋白的45．7％，经纯化后纯度可达98．4％，活性检测证实其能明显刺激外周血淋巴细胞活化。结论 利用大肠杆菌可高效表达rhBAFF112—285，所获纯化产物具有生物学活性，所获结果为进一步研究创造了条件。     

硕士研究生分子生物学教学体会

搞好硕士研究生分子生物学教学是一项重要而艰巨的课题。认为，在硕士研究生分子生物学教学中，采取讲授教材与新进展专题讲座相结合，编写并使用提纲式分子生物学进展讲座教材来辅助教学，使用中英文“鸡尾酒”式授课方法，注重传授快速获取分子生物学新知识的技巧，保持分子生物学实验课的连续性，坚持闭卷问答式考试与撰写综述和实验设计相结合的成绩办法等策略，有利于搞好分子生物学教学和全面提高硕士研究生的分子生物学理论和实践水平。     

长程高脂饲料对雌雄大鼠胰岛功能损害差异的探讨

目的动态观察长程高脂饲料对雌雄大鼠糖耐量和胰岛素作用的影响，并探讨其可能的机制。方法取正常SD大鼠100只，抽签式随机分组，其中雄性和雌性大鼠普通饲料组各20只，雄性和雌性大鼠高脂饲料组各30只。每个月动态监测大鼠体质量及空腹血糖的变化，在第14个月时进行腹腔注射糖耐量试验（IPGTT），检测葡萄糖耐量减退（IGT）的情况，测定第14个月时的空腹胰岛素分泌量及大鼠胰腺组织匀浆液中线粒体和微粒体的丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢酶（calalase，CAT）水平。结果第14个月时无论普食组或高脂组雄性大鼠腹腔注射糖耐量都受损，而雌性大鼠都未达到糖耐量受损，腹腔糖耐量测试表明雌雄大鼠在120min时血糖有显著性差异（P〈0．05）；14个月时高脂组雄性大鼠空腹胰岛素分泌量显著高于雌性大鼠（P〈0．05）；胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）显示高脂组雄性大鼠胰岛素抵抗程度较雌性大鼠显著升高（P〈0．05）；早相胰岛素分泌功能显示经过长程高脂喂养，雄性大鼠早相胰岛素分泌功能显著低于雌性大鼠（P〈0．05）；胰腺组织匀浆液中线粒体的MDA、细胞质的GSH和CAT的水平雌雄大鼠间虽然无显著性差异（P〉0．05），但总体趋势是无论是普食组还是高脂组，雄性大鼠氧化应激水平都高于雌性大鼠，抗氧化应激水平都低于雌性大鼠。结论雌性大鼠具有抵抗高脂诱导的糖耐量受损作用，其胰腺组织氧化应激水平较低可能是机制之一。     

睾酮对乳腺癌细胞中FEN1表达的影响

目的 探讨睾酮(testosterone,T)在乳腺癌细胞中对瓣状核酸内切酶(flap endonuclease 1,FEN1)表达的影响及其机制.方法 以MCF-7作为研究对象,采用RT-PCR观察雌二醇(17 β-estradiol,E2)单独作用以及分别与雌激素受体(estrogen receptor,ER)拮抗剂ICI182,780(ICI)和MAPK途径抑制剂U0126共同作用时FEN1表达的变化.以MCF-7aro(芳香化酶过表达的MCF-7)作为研究对象,采用RT-PCR观察加入单独的睾酮以及睾酮和芳香化酶抑制剂来曲唑(letro-zole)共同作用时FEN1表达的变化；采用Western blot观察睾酮单独作用以及分别与来曲唑和U0126共同作用时FEN1、p-ERK和p-Elk的变化.结果 与对照组比较,加入雌二醇后MCF-7细胞中FEN1 mRNA的表达升高2.04倍(P＜0.01),加入ICI和U0126后分别降低10.63倍和2.17倍(P＜0.01).加入睾酮后MCF-7aro细胞中FEN1 mRNA的表达升高1.66倍(P＜0.01),蛋白的表达升高1.80倍(P＜0.01)；加入来曲唑后FEN1 mRNA的表达下降2.38倍,蛋白的表达降低1.84倍,加入U0126后蛋白的表达降低2.28倍(P＜0.01)；加入睾酮后ERK和Elk-1的磷酸化水平分别升高2.28倍和2.60倍(P＜0.01),加入来曲唑后ERK和Elk-1的磷酸化水平分别降低2.60倍和2.37倍(P＜0.01),加入U0126后ERK和Elk-1的磷酸化水平分别降低10.38倍和119.50倍(P＜0.01).结论 睾酮可通过MAPK途径上调MCF-7 aro细胞中FEN1的表达.