慢性粒细胞白血病bcr/abl的糖基化磷脂酰肌醇锚定修饰及在COS-7细胞膜上的表达

目的 构建与糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定序列相连的bcr/abl真核表达质粒,并检测其在COS-7细胞中基因和膜蛋白的表达.方法 以编码慢性粒细胞白血病bcr/abl融合蛋白全长序列的migP210质粒为模板,通过PCR扩增获得654 bp的bcr/abl融合基因片段,双酶切后定向插入真核表达载体pBudCF4.1中,经鉴定获得重组质粒pBB.同时用RT-PCR扩增人外周血淋巴细胞CD24分子中的GPI获得约243 bp的锚定序列,双酶切后克隆人pBB质粒中与ber/abl基因下游羧基端相连,获得重组质粒pBBG.在多聚阳离子介导下将pBBG质粒转染COS-7细胞,采用RT-PCR和Western blot检测bcr/abl融合基因和蛋白的表达.结果 经酶切和测序鉴定证实,由GPI锚定连接的ber/abl融合基因插入片段正确;RT-PCR检测到转染细胞中有bcr/abl融合基因,Western blot检测到转染细胞膜上有hcr/abl融合蛋白的表达.结论 成功构建由GPI锚定修饰的bcr/abl重组质粒pBBG,并能在COS-7细胞膜上表达出bcr/abl融合蛋白.     

HCV核心蛋白对HepG2细胞增殖的影响

目的 利用腺病毒表达系统,研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)核心蛋白对HepG2细胞增殖、Wnt1以及microRNA152(miR-152)表达水平的影响.方法 通过HEK293细胞扩增腺病毒获得高滴度的Ad-EGFP和Ad-HCV core,分别感染HepG2细胞后,通过RT-PCR和Western blot证实HCV核心蛋白在HepG2细胞中高效表达.MTT法、细胞周期测定和克隆形成实验检测HCV核心蛋白对HepG2细胞增殖的影响.SYBR探针荧光定量PCR和Western blot检测的HepG2-HCV core细胞中Wnt1和miR-152表达的变化.用miR-152 inhibitor转染HepG2细胞后,SYBR探针荧光定量PCR、Western blot检测HepG2细胞中Wnt1 mRNA和蛋白表达水平变化.结果 Ad-GFP和Ad-HCV core腺病毒经HEK293扩增后滴度分别为1.5×109 pfu/mL和1.6×1010pfu/mL.Ad-HCV core腺病毒感染HepG2细胞后,HCV核心蛋白高效表达.感染48 h后,与HepG2-Mock细胞相比,Ad-HCV core可显著促进HepG2细胞增殖(P＜0.05),加快G1/S细胞周期进展(P＜0.05),并促进细胞克隆形成(P＜0.05).Ad-HCV core腺病毒感染可在显著上调HepG2细胞中Wnt1 mRNA和蛋白表达量(P＜0.05)的同时下调miR-152表达水平.同时,miR-152 inhibitor可显著上调Wnt1 mRNA和蛋白水平.进一步生物信息学分析显示,Wnt1基因mRNA 3'-UTR含有miR-152结合位点.结论 HCV核心蛋白可能通过抑制miR-152而减弱其对Wnt1 mRNA的降解及翻译阻碍作用,进而达到上调Wnt1致Wnt信号通路激活,促进肝癌细胞增殖的效应.     

浅谈甘草的配伍运用

补益脾胃,滋养气血在古今补益类方剂中,多配伍炙甘草。著名的炙甘草汤以益心气、养心阳而复脉,治疗心阴心阳俱虚所致的心悸动、脉结代见称,此方即以炙甘草为主药而命名。我们临床常用的后世医家名方如:补脾益气的四君子汤、补中益气汤,益气血、养心脾的归脾汤,补气血、养心营的     

bcr-abl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病样模型的建立

目的:构建bcr-abl逆转录病毒介导的小鼠慢性粒细胞白血病(CML)样模型,为深入研究CML发病机制和治疗奠定基础.方法:bcr-abl逆转录病毒Mig210载体经Phoenix-Ampe细胞包装后,取上清液感染5-FU处理后的BALB/c雄性小鼠骨髓细胞,再经尾静脉移植入经致死剂量γ射线(900cGy)照射的同种雌性受体鼠中.用形态学、RT-PCR和Western Blot鉴定小鼠成模情况.结果:小鼠移植8～9 wk后,外周血白细胞达2×1010～3×1010/L(为对照鼠的5～8倍),外周血涂片幼稚细胞达到0.10～0.20;骨髓粒系细胞显著增高,易见幼稚细胞,肝脾也可见白血病细胞浸润;移植4～5wk后在受体鼠骨髓和脾脏检出bcr-abl融合基因,8～9 wk后在肝脏亦检测出bcr-abl融合基因,同时在骨髓和脾脏也检测到bcr-abl融合蛋白.建模成功的小鼠3～5 Ino后相继死亡.结论:成功建立bcr-abl逆转录病毒介导的小鼠CML模型,可用于后续CML信号通路和治疗机制的研究.     

Fox转录因子家族在正常和胆道结扎小鼠肝脏中的动态表达

目的研究Forkhead盒(Fox)转录因子在正常和肝胆管结扎致纤维化的Balb/c小鼠肝脏中的动态表达。方法逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测正常Balb/c小鼠肝脏中包括Foxo1、Foxo3、Foxm1、Foxl1等18个Fox转录因子的表达,并用荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)检测肝胆管结扎后Balb/c小鼠肝脏中9个炎症和增殖相关性Fox转录因子的mRNA动态变化。结果 18个Fox转录因子基因在正常Balb/c小鼠肝脏中均有表达,且以Foxo1和Foxo3表达最高;肝胆管结扎后Foxo1表达显著下调,而Foxol1和Foxm1表达显著增高。结论肝胆管结扎致纤维化的Balb/c小鼠肝脏中,炎症和增殖相关性Fox转录因子的动态改变提示Fox转录因子可能参与肝纤维化的发生。     

重组蛋白转导域-寡聚化域-血凝素融合蛋白抑制慢性粒细胞白血病BaF3-P210细胞小鼠致瘤能力

目的:探讨重组蛋白转导域-寡聚化域-血凝素(protein transduction domain-oligomerization domain-hemagglutinin,PTD-OD-HA)对慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)BaF3-P210细胞小鼠致瘤能力的影响。方法:将BaF3-P210细胞和经40μmol/L PTD-OD-HA处理48h的BaF3-P210细胞分别经尾静脉注射入BALB/c小鼠体内,观察小鼠一般状况以及生存时间,计数外周血白细胞,外周血和骨髓涂片进行Wright-Giemsa染色,肝、脾和肺等各主要脏器组织进行HE染色,蛋白质印迹法检测小鼠骨髓细胞bcr/abl蛋白的表达。结果:BaF3-P210细胞组和经PTD-OD-HA处理的BaF3-P210细胞组小鼠CML发病率分别为90%(9/10)和80%(8/10),外周血白细胞计数分别为(44.3±4.8)×109/L和(20.6±3.2)×109/L(P<0.05),骨髓细胞中bcr/abl癌蛋白表达量分别为5.13±0.46和1.32±0.29(P<0.05),平均生存期分别为(101.3±6.2)d和(185.4±8.7)d(P<0.05)。Wright-Giemsa染色可见,经PTD-OD-HA处理的BaF3-P210细胞组小鼠骨髓、肝脏和脾脏中的白血病细胞浸润程度比BaF3-P210细胞组下降。结论:经PTD-OD-HA处理后的BaF3-P210细胞在BALB/c小鼠体内的致白血病潜能明显受到抑制。     

PTD-OD-HA融合蛋白对K562细胞中Bcr-Ab1的抑制作用观察

目的 探讨PTD-OD-HA融合蛋白转导K562细胞的动力学、定位及其与Bcr-Ab1定位的关系,以及对Bcr-Ab1寡聚化和Bcr-Ab1酪氨酸激酶活性的影响.方法 采用FITC标记PTD-OD-HA融合蛋白,观察蛋白转导K562细胞的效率与剂量和时间的关系,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在细胞内的定位,免疫共沉淀法检测融合蛋白与Bcr-Ab1的相互作用,Western blotting检测Bcr-Ab1的磷酸化水平.结果 PTD-OD-HA转导K562细胞呈剂量和时间依赖性.PTD-OD-HA定位于K562细胞胞质,与Bcr-Ab1共定位,且能与Bcr-Ab1蛋白相互作用,进而干扰Bcr-Ab1同源寡聚化,并可降低Bcr-Ab1的磷酸化水平.结论 在K562细胞中,PTD-OD-HA融合蛋白能有效抑制Bcr-Ab1同源寡聚化及磷酸化水平.     

PTD-OD-HA融合蛋白对K562细胞中Bcr-Ab1的抑制作用观察

目的探讨PTD-OD-HA融合蛋白转导K562细胞的动力学、定位及其与Bcr-Abl定位的关系,以及对Bcr-Abl寡聚化和Bcr-Abl酪氨酸激酶活性的影响。方法采用FITC标记PTD-OD-HA融合蛋白,观察蛋白转导K562细胞的效率与剂量和时间的关系,激光共聚焦显微镜检测融合蛋白在细胞内的定位,免疫共沉淀法检测融合蛋白与Bcr-Abl的相互作用,Western blotting检测Bcr-Abl的磷酸化水平。结果 PTD-OD-HA转导K562细胞呈剂量和时间依赖性。PTD-OD-HA定位于K562细胞胞质,与Bcr-Abl共定位,且能与Bcr-Abl蛋白相互作用,进而干扰Bcr-Abl同源寡聚化,并可降低Bcr-Abl的磷酸化水平。结论在K562细胞中,PTD-OD-HA融合蛋白能有效抑制Bcr-Abl同源寡聚化及磷酸化水平。     

探讨多聚胞嘧啶结合蛋白E2诱骗RNA对32D-BCR/ABL细胞增殖的影响

目的:在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)由慢性期向急性期的过渡阶段伴随有多聚胞嘧啶结合蛋白E2[poly(rC)-binding protein E2,hnRNP E2]的异常表达.本研究初步探讨hnRNP E2诱骗RNA(decoy RNA)对32D-BCR/ABL细胞增殖的影响及其可能的分子机制.方法:用电转染方法将hnRNP E2诱骗RNA野生序列和突变序列的表达载体(pGD和pGM)转入32D-BCR/ABL细胞,用G418筛选出稳定表达诱骗RNA的细胞.锥虫蓝染色法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力.FCM分析细胞周期,RT-PCR和Western印迹法检测下游CCAAT增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α,C/EBPα)和c-Myc的表达.结果:筛选出稳定表达野生型和突变型诱骗RNA 的32DP210-pGD细胞和32DP210-pGM细胞.野生型32DP210-pGD细胞与未转染32D-BCR/ABL细胞相比,其细胞增殖抑制率为(69.48±5.21)%,克隆形成能力明显减弱,细胞周期由G0/G1期向S期进展受阻;C/EBPα mRNA水平无改变,但在蛋白水平上42 ku-C/EBPα的表达增加(43.83±4.91)%;c-Myc mRNA水平下降(35.67±6.64)%,蛋白水平降低(30.91±3.84)%.突变型32DP210-pGM细胞与未转染32D-BCR/ABL的细胞相比,其上述各指标无明显差异.结论:hnRNP E2诱骗RNA能够抑制32D-BCR/ABL细胞的增殖,其机制可能是诱骗RNA阻断hnRNP E2和C/EBPα mRNA的结合,引起42 ku-C/EBPα表达增加,进而引起其下游靶基因c-Myc下调.