生理性张应变通过增加核骨架蛋白Emerin表达抑制血管平滑肌细胞凋亡

目的探讨细胞核骨架蛋白Emerin及其调控的转录因子在感受张应变力学刺激影响血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)凋亡中的作用。方法应用FX-5000T张应变加载系统,对体外培养的VSMCs施加5%幅度、1.25 Hz频率生理性张应变,以静止组为对照;应用cleaved-caspase3 ELISA试剂盒检测VSMCs凋亡水平,Western blotting检测VSMCs细胞核骨架蛋白Emerin蛋白表达水平。静态条件下,RNA干扰抑制VSMCs的Emerin表达,Protein/DNA芯片检测345种转录因子活性;将特异性干扰Emerin后活性发生明显变化(上调或下调超过2倍)的转录因子进行IPA(Ingenurity Pathway Analysis)信息学分析,筛选与凋亡功能相关的转录因子;染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)结合q PCR检测特异性干扰Emerin对其与两种转录因子motif区域结合能力的影响。结果与静止组相比,5%生理性张应变加载24 h后,VSMCs凋亡水平显著降低,提示生理性张应变对细胞具有保护作用;5%张应变作用6、12和24 h均显著增加VSMCs的Emerin表达水平。静态条件下RNA干扰抑制Emerin表达,VSMCs凋亡水平显著增加,且10种参与细胞凋亡功能调控的转录因子活性显著上调(2倍以上),包括CREB-BP1、p300、p55、MAX、NRF-1、STAT1、STAT3、TEF1、TR和BZP;CHIP-q PCR结果显示,Emerin特异性干扰可以显著降低Emerin与STAT家族的两个成员STAT1和STAT3的motif区域结合能力。结论生理性张应变可能通过增加核骨架蛋白Emerin表达而调控Emerin与STAT1、STAT3等多种凋亡相关转录因子motif区域结合,进而调控转录因子活性影响VSMCs凋亡。探讨张应变力学刺激调控VSMCs功能的力学生物学分子机制,对揭示血管生理稳态维持和血管病理重建的分子机制具有一定意义。     

FOXO1参与高血压条件下异常张应变诱导的血管平滑肌细胞增殖

目的 探讨高血压条件下异常升高的周期性张应变刺激对血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）增殖的影响,以及Forkhead转录因子1（FOXO1）在其中可能的作用。方法 构建腹主动脉缩窄高血压大鼠模型,并以假手术组为对照,应用FX-4000T体外周期性张应变加载系统,分别对VSMCs施加5%的生理性张应变和15%的高血压病理性张应变。Western blot检测VSMCs的FOXO1及p-FOXO1表达水平,BrdU法检测VSMCs 增殖活性。RNA干扰技术抑制VSMCs的FOXO1表达,检测FOXO1、p-FOXO1表达以及VSMCs增殖活性变化。结果 腹主动脉缩窄术后 2和4周,大鼠血压较假手术大鼠明显增高。与假手术大鼠相比,高血压大鼠血管壁细胞增殖活性明显增高,同时 FOXO1及 p-FOXO1表达水平也显著性升高。细胞实验表明,与5%张应变组相比,15%张应变加载显著上调VSMCs的FOXO1、p-FOXO1表达水平,以及VSMCs增殖活性。静态条件下RNA干扰抑制VSMCs的FOXO1及p-FOXO1表达,VSMCs的增殖活性明显降低。结论 高血压病理条件下,异常增高的周期性张应变可能通过促进 FOXO1表达和磷酸化诱导VSMCs增殖。以动物模型观察现象,在细胞分子水平探讨机制,旨在明确FOXO1在高血压血管重建中的作用及其力学生物学机制,为阐明高血压血管重建的发病机理和药物治疗靶标的研究提供新的实验依据。     

长链非编码RNA XR007793在病理性高张应变诱导平滑肌细胞增殖中的作用

目的探讨高血压条件下异常升高的周期性张应变刺激对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖活性的影响以及VSMCs中一种长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)XR007793在其中可能的作用。方法应用体外周期性张应变加载系统Flexcell-4000对VSMCs分别施加5%生理性张应变和15%病理性高张应变,加载频率为1.25 Hz,加载时间24 h。荧光实时定量PCR检测XR007793及其共表达基因:信号转导与转录激活因子2(STAT2)、细胞分裂相关蛋白8(CDCA8)、原癌基因LMO2和干扰素调节因子(IRF7)的表达变化,Western bloting方法检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达变化,RNA干扰技术抑制VSMCs的XR007793表达,静态条件下流式细胞术检测VSMCs周期变化,牵拉条件下Brdu检测VSMCs增值变化情况。结果与5%生理性张应变组相比,15%病理性高张应变显著下调XR007793表达水平,促进VSMCs增值活性并上调STAT2和CDCA8的表达水平。静态条件下干扰XR-007793,VSMC增殖水平显著上升。高周期性张应变条件下干扰XR-007793,VSMC增殖水平上升,CDCA8表达水平上升。结论病理性高张应变可能通过降低XR007793表达来影响CDCA8表达变化,进而调控VSMCs增殖功能变化过程。研究结果为阐明高血压条件下血管重建机制和药物治疗靶标的研究提供新的实验依据。     

不同频率张应变作用下血管磷酸化HSP27的表达及其在血管平滑肌细胞迁移中的作用

目的研究血管和血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)磷酸化热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)在不同频率张应变条件下的表达变化及其对VSMCs迁移的影响。方法应用血管体外应力培养系统,在频率为0.5Hz和1.25Hz、平均压力15.996 kPa(120mmHg)和平均流量50mL/min的条件下培养猪颈总动脉,培养时间为24h;又用Flexercell细胞应变加载系统,对人VSMCs施加0.5Hz和1.25Hz频率的10%张应变,加载时间为12h。然后,Western blot检测不同频率张应变作用下血管和VSMCs的磷酸化HSP27的表达变化。应用RNA干扰技术,分别观察抑制HSP27表达前后的VSMCs迁移能力变化。结果与频率为0.5Hz作用相比,1.25Hz张应变可以激活血管和VSMCs的HSP27表达,抑制VSMCs迁移。RNA干扰HSP27后,VSMCs迁移数量明显增多。结论正常生理频率张应变可能通过激活血管HSP27抑制VSMCs迁移,以维持血管正常的结构和功能。     

周期性张应变调控血管平滑肌细胞黏附血小板微体及其在自噬中的作用

目的探讨周期性张应变力学刺激对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)与血小板微体(platelet-derived microparticles,PMPs)黏附能力的影响,以及黏附的PMPs对VSMCs自噬的调控作用。方法应用FX-5000T张应变加载系统,对体外培养VSMCs施加5%幅度的生理性张应变和15%幅度的高张应变;应用流式细胞术检测不同张应变作用的VSMCs与PMPs的黏附;免疫荧光检测PMPs刺激24 h后自噬标志分子微管相关蛋白轻链3(autophagy microtubule associated protein light chain 3,LC3)的表达水平; Western blotting检测PMPs刺激24 h后VSMCs自噬相关蛋白(autophagy related protein,Atg)的表达水平。结果与5%生理性张应变加载相比,15%高张应变加载24 h能显著增强VSMCs与PMPs的黏附水平,提示高张应变促进PMPs与VSMCs的黏附。免疫荧光和Western blotting结果显示,PMPs刺激可显著上升VSMCs中自噬标志蛋白LC3表达,同时Western blotting检测到PMPs刺激后Atg5、Atg7、Atg12蛋白表达水平显著上升。结论高张应变可以促进VSMCs黏附PMPs,黏附的PMPs可能通过增加Atg5、Atg7、Atg12、LC3表达,从而增强VSMCs自噬。     

力-血管蛋白质组学研究进展

力学因素调控血管生理性稳态和病理性重建的机制是力学生物学中应力-生长研究的重要内容,迄今尚未完全阐明。蛋白质组学这一高通量、系统性的新技术在血管力学生物学领域的应用,将生物力学、蛋白质组学、生物信息学与分子生物学相关研究理念和研究技术相结合,能够为心血管疾病发病机理研究和血管重建药物治疗靶向的寻找提供一个全新的力学生物学视角,也体现了学科交叉融合的创新特色和科学价值。近年来,上海交通大学力学生物学研究所遵循"力学生物学实验发现现象-生物信息学分析-生物学实验验证结论"开展了多学科相结合的系统性研究,建立了可能的血管细胞内机械应力信号传导网络。此外,基于力-血管蛋白质组学研究,揭示了60多种新的、可能参与了机械应力细胞内信号传导过程的信号分子,并深入探讨部分分子在应力调控血管细胞功能中的作用及分子机制。在研究所工作的基础上,综述了近年来力-血管蛋白质组学相关研究进展。力-血管蛋白质组学的研究工作有望为高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病血管重建病理机制揭示、临床治疗潜在靶点寻找提供重要的力学生物学实验依据。     

microRNA-214-3p在周期性张应变诱导内皮祖细胞分化和增殖中的作用

目的探讨microRNA-214-3p(miR-214-3p)在周期性张应变诱导内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)分化和增殖中的作用。方法采用FX-5000T细胞周期性张应变加载装置对EPCs施加生理水平的周期性张应变(5%幅度、1.25 Hz频率),加载时间24 h。应用miRNAs芯片筛选周期性张应变调控下差异表达的miRNAs,并挑选miR-214-3p进行深入研究。实时荧光定量PCR方法检测EPCs内平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)相标志分子的表达,BrdU结合酶联免疫吸附ELISA法检测EPCs增殖功能。之后,使用miR-214-3p抑制剂抑制miR-214-3p的表达,检测EPC内VSMC相标志分子表达及EPCs增殖。结果周期性张应变显著抑制miR-214-3p表达,并抑制EPCs向VSMC相分化,同时显著促进EPCs增殖。在静态条件下,使用miR-214-3p抑制剂干扰miR-214-3p的表达,miR-214-3p水平下降同样会抑制EPCs向VSMC相分化,并且诱导EPCs增殖能力显著上升。结论生理水平的周期性张应变能够抑制EPCs内miR-214-3p表达,从而抑制EPCs向VSMC相分化,并且促进EPCs增殖。研究结果为血管损伤的治疗提供新的治疗靶点。     

Rab28相关信号通路在低切应力诱导 血管平滑肌细胞迁移中的作用

目的 研究低切应力（low shear stress, LowSS）诱导的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）迁移功能异常在动脉粥样硬化血管重建病理过程中的作用及其分子机制。 方法 应用双向凝胶电泳结合质谱分析的差异蛋白质组学方法,研究1.5 Pa正常切应力（normal shear stress, NSS）与0.5 Pa LowSS条件下培养血管组织的蛋白质差异表达谱。应用血管内皮细胞（endothelial cells, ECs）与VSMCs联合培养的平行平板流动腔系统,分别施加NSS和LowSS,Western blot检测ECs与VSMCs的Rab28表达水平以及VSMCs的磷酸化ERK表达水平;Transwell法检测VSMCs的迁移能力;RNA干扰和PD98059分别特异性抑制VSMCs的Rab28表达和ERK磷酸化,再观察VSMCs迁移能力变化。结果 血管差异蛋白质组学的结果发现,与NSS组相比,Rab28在LowSS组血管组织的表达水平明显升高。细胞实验结果显示,LowSS加载明显上调VSMCs的Rab28蛋白表达、VSMCs迁移和ERK磷酸化。静态条件下RNA干扰抑制单独培养VSMCs的Rab28表达,VSMCs迁移能力明显降低,但ERK磷酸化水平无明显变化;应用PD98059特异性抑制VSMCs的ERK磷酸化,VSMCs迁移能力和Rab28表达水平均明显降低。结论 LowSS可能通过上调VSMCs的ERK磷酸化水平引起Rab28表达水平增加,从而诱导VSMCs迁移。探讨Rab28及其相关信号通路在切应力调控VSMCs功能中的作用及其机制,可能为深入理解动脉粥样硬化血管重建疾病发病机制和寻找新的药物治疗靶点提供力学生物学依据。     

microRNA-34a在低切应力诱导血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的探讨micro RNA-34a(mi R-34a)在低切应力诱导血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖中的作用。方法应用细胞联合培养平行平板流动腔系统对与VSMCs联合培养的内皮细胞(endothelial cells,ECs)施加1.5 Pa正常切应力(normal shear stress,NSS)和0.5 Pa低切应力(low shear stress,Low SS),加载时间为12 h。Western blotting检测联合培养VSMCs的增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达,以此反映VSMCs的增殖能力。实时PCR检测联合培养VSMCs的mi R-34a表达变化。通过Target Scan、mi RWalk等网站预测mi R-34a的下游靶蛋白。Western blotting检测联合培养VSMCs的mi R-34a靶蛋白Forkhead转录因子J2(forkhead box j2,Foxj2)表达。通过mimics和inhibitor转染技术,分别上调和抑制VSMCs的mi R-34a表达,Western blotting检测Foxj2及PCNA的表达变化,验证mi R-34a和Foxj2之间的调控关系。结果与NSS相比,Low SS促进联合培养VSMCs的PCNA表达,并显著上调联合培养VSMCs的mi R-34a表达。通过Target Scan、mi RWalk等网站预测mi R-34a的下游靶蛋白为Foxj2。Low SS加载下联合培养VSMCs的mi R-34a靶蛋白Foxj2表达明显降低。静态条件下上调VSMCs的mi R-34a表达,靶蛋白Foxj2表达明显降低,PCNA表达显著升高;抑制VSMCs的mi R-34a表达,靶蛋白Foxj2表达明显上调,PCNA表达显著降低。结论 Low SS通过调控联合培养VSMCs的mi R-34a和靶蛋白Foxj2,促进VSMCs增殖。研究结果为进一步阐明动脉粥样硬化疾病的发病机制及药物治疗靶标提供新的力学生物学实验依据。     

在高血压动脉重建中microRNA-21对血管平滑肌细胞细胞外基质表达的调控作用

目的探讨在高血压动脉重建中microRNA-21(miR-21)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的调控作用及其机制。方法建立腹主动脉缩窄型大鼠高血压模型,大鼠分为假手术对照组、高血压2周组和高血压4周组;对体外培养的大鼠主动脉VSMCs施加频率为1.25 Hz周期性张应变,加载幅度分别为0%(静态对照组)、5%(正常张应变组)、15%(模拟高血压状态的高张应变组),加载持续时间均为12 h。采用Western blotting和Real time RT-PCR技术,分别检测动脉和细胞样品ECM以及miR-21的表达。用miR-21特异干扰片段抑制培养的VSMCs miR-21表达,然后检测VSMCs的ECM、miR-21和Smad 7表达变化。结果与假手术对照组相比,高血压2周组胸主动脉ECM和miR-21的表达显著上升;高血压4周组胸主动脉的I型胶原、III型胶原和miR-21表达显著上升。与静态对照组和5%张应变组相比,15%张应变组VSMCs的I型胶原表达无显著变化,而III型胶原表达显著升高,Smad 7表达显著下降,周期性张应变增强VSMCs的miR-21表达。干扰miR-21降低周期性张应变状态下VSMCs的miR-21表达以及III型胶原蛋白水平表达,上调VSMCs的Smad 7表达。结论高血压血管重建导致大鼠胸主动脉ECM和miR-21高表达。周期性高张应变可诱导VSMCs的miR-21高表达,再通过其调节Smad 7蛋白,进而调控VSMCs的ECM,尤其是III型胶原的表达,参与高血压血管重建。