大鼠皮肤的冷冻干燥保存

背景：细胞干燥保存的研究报道较多,组织器官是否适用于干燥保存,尚缺乏证据。 目的：用海藻糖作为干燥保护剂,优化海藻糖载入大鼠皮肤的条件,探索皮肤干燥保存的可行性。 设计、时间及地点：观察性实验,于2007-11/2008-11在西北大学生命科学学院组织工程实验室完成。 材料：体质量150 g左右成年SD大鼠。海藻糖由Sigma公司提供。 方法：通过控制海藻糖浓度(50,300,500,800,1 000 mmol/L)、负载时间(0.5,4,7,9 h)和温度[4 ℃、4~37 ℃(相转变)和37 ℃],优化海藻糖导入大鼠皮肤的条件。将负载海藻糖的皮肤置于含100 g/L二甲基亚砜的DMEM冷冻液中孵育,程序冷冻仪以1 ℃/min的速率降温至-80 ℃后移入冷冻干燥机中进行冻干。将冻干皮肤水化复苏后分别用双醋酸羧基荧光素(CFDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测皮肤活性,并以新鲜和甲醛固定皮肤的吸光度值作为阳性和阴性对照。以苏木精-伊红染色和观察皮肤组织结构,并进行自体移植。 主要观察指标：海藻糖在不同加载浓度、孵育温度和时间载入大鼠皮肤的情况。冻干皮肤水化后的形态学、组织学变化及其自体移植后存活情况。 结果：海藻糖浓度小于800 mmol/L,皮肤的海藻糖载入量随海藻糖浓度的升高而明显增(P < 0.05),浓度大于800 mmol/L,海藻糖载入量差异不显著。孵育温度为37 ℃组和相转变组皮肤海藻糖载入量明显高于4 ℃组(P < 0.05),相转变组与37 ℃组差异无统计学意义。皮肤孵育4,7,9 h的海藻糖载入量明显高于孵育0.5 h的载入量(P < 0.05),孵育时间为4,7,9 h之间的海藻糖载入量差异不显著,但孵育7 h后皮肤的海藻糖载入量不再增加。实验以海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37 ℃,孵育时间为7 h为优化的负载条件处理大鼠皮肤。冻干皮肤玻璃化状态良好,呈半透明状。水化后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽,组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织无差别。冷冻干燥皮肤的活性明显高于甲醛固定的大鼠皮肤 (P < 0.05)。冻干保存的皮肤水化后移植回自体大鼠,可存活长达13 d。 结论：海藻糖可作为干燥保护剂进行大鼠皮肤冷冻干燥保存,海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37 ℃,孵育时间为 7 h是海藻糖载入大鼠皮肤的最佳条件。     

糖尿病流行病学调查中实验室工作的质量控制

我们以 1997年 3月广东省广宁县在参加全国糖尿病流行病学调查 (简称流调 )时现场和实验室血糖测定的质控为实例 ,进行详细的介绍。对象与方法一、对象对象来源于作为广东省贫困地区的广宁县 ,包括城镇和乡村 ,随机抽查 16 6 7例年龄在 2 0～ 74岁的常住 (5年及 5年以上 )居民的流调血糖测定结果。二、方法1.人员的培训和技术考核 :首先成立调查小组 ,选定已通过国家有关部门技术质量认证的实验室作为流调血糖测定的实验室 ,然后办培训班 ,并对参加测定血糖的技术人员进行考核。考核方法 :调查组向参加血糖测定的实验室发出质控血清 ,要求测定 3次 ,取均值 ,然后将结果寄回调查组。调查组采用偏离指数 DI法进行评分 :DI=X- XX × 1 0 0 %5% =X- XX × 2 0DI为偏离指数 ,X为实验室测定血糖均值 ,X 为血糖质控血清靶值 ,5 %为偏离率 (常数 )。 DI<0 .5为优秀 ,DI=0 .5～0 .99为良好 ,DI=1.0～ 1.6为及格 ,DI>1.6为不及格。要求实验室 DI值须达到及格以上 ,方能参加本次的流调 [1 ]。2 .血糖测定方法 :血糖测定用氟化钠抗凝葡萄糖氧化酶法 ,采用北京中生生物工程高技术公司出品试剂、标准物、质控血清 ,HITACHI70 6 0型全自动生化分析仪测定血糖。3.标本的采集 :做好组织工作 ,调查者抽血前 8～     

米非司酮用于紧急避孕(附30例临床观察)

自1998年10月至1999年9月,我院对要求紧急避孕的部分妇女给予口服米非司酮,取得满意效果,报告如下. 1 资料与方法 1.1 一般资料本组30例均处于易孕期,无口服米非司酮禁忌证,在性生活后72 h内就诊.其中12h内就诊者20例,24 h内者5例,48 h内者3例,72h内者2例;未采取避孕措施者29例,避孕套破裂或滑脱者10例;年龄20～45岁,平均年龄30岁,月经周期均规律(28～30 d).     

中和试验发现西安地区为肾综合征出血热混合型疫区

目的 调查陕西西安地区汉坦病毒感染现状,分析当地肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫源地性质.方法 根据HFRS发病报告数据,分析西安HFRS的发病特点.通过荧光定量RT-PCR方法,检测西安HFRS疫区家鼠和野鼠携带汉坦病毒情况及病毒型别.微量中和试验确定西安本地HFRS病人、HFRS疫苗接种者和隐性感染者血清中的汉坦病毒中和抗体水平并分型,回顾性调查阳性感染者.结果 西安地区HFRS发病每年均有6-7月份的小高峰和10-12月份的大高峰;在当地642只家鼠和1 546只野鼠肺组织中检出汉滩病毒RNA136份;143份人血清中123份检测到汉坦病毒中和抗体,未检测到中和抗体的有20份.中和抗体阳性者中判定为汉滩病毒感染者92人,占74.80％;判定为汉城病毒感染者3人,占2.44％;不能区分病毒感染型别者28人,占22.76％,3例感染汉城病毒者分别为HFRS病人、疫苗接种者和隐性感染者,调查显示3例均为本地感染.结论 实验室和现场调查证实当地存在汉城型病毒本地感染,陕西西安地区是以汉滩病毒型为绝对优势的HFRS混合型疫区.     

急性期SARS患者血细胞变化的观察

传染性非典型肺炎是全球流行的新型烈性传染病，由于临床症状以呼吸系统表现为主，2003年WHO将它命名为严重急性呼吸综合征(Severe a-cute respiratory syndrome，SARS)。前期研究表明SARS病原体为新型冠状病毒，WHO称其为SARS冠状病毒(SARS-CoV)。SARS-CoV属于核     

甲状腺相关眼病患者干眼症患病率与泪膜功能及角膜状况研究

目的：研究甲状腺相关眼病(TAO)患者干眼症患病率与泪膜功能及角膜状况。

方法：选取2014-09/2016-08在本院接受治疗并确诊为TAO的患者218例436眼,依据TAO的临床活动度评分(CAS)把患者分成两组：评分≥4分为活动期患者,共72例144眼; 评分<4分为非活动期患者,共146例292眼; 依据患者病程情况分成三组,低于1a为短病程组,共133例266眼; 病程1～2a为中病程组,共40例80眼,大于2a为长病程组,共45例90眼; 对比患者进行角膜荧光素染色(FS)、泪膜破裂时间(BUT)和泪液分泌试验(S I t)检测情况。

结果：患者218例中共有138例276眼诊断是干眼症; 其中活动期患者患病率高于非活动期患者,差异有统计学意义(P<0.05),短病程组患者患病率高于中病程组和长病程组,和长病程组对比差异有统计学意义(P<0.05); 三组不同病程患者在BUT与S I t检测方面比较,差异无统计学意义(P>0.05),在FL检测方面对比差异有统计学意义(P<0.05); 非活动期患者和活动期患者在FS、BUT和S I t检测方面对比差异均有统计学意义(P<0.05)。

结论：多数TAO患者泪液分泌不充分、泪膜不够稳定,近1/3 TAO患者的角膜上皮出现损坏,患干眼病几率比正常人显著增加。     

间充质干细胞对脐血CIK／NK细胞CD69表达及培养体系中T调节细胞量比的影响

本研究通过Transwell细胞隔离培养体系探讨骨髓源间充质干细胞（MSC）对脐血（CB）来源细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）／自然杀伤细胞（NK）CD69的表达以及对培养体系中CD4^＋CD25^＋T调节（Treg）细胞量比的影响。利用聚碳酯膜孔径0．4μm的Transwell隔离细胞培养系统将实验组分为隔离培养（Transwell）组和直接混合（mixture）培养组;将MSC和CIK／NK细胞按1：20、1：50和1：100的比例分别在Transwell组和mixture组中进行隔离和直接混合培养,每组6个重复孔;培养48小时后通过流式细胞术检测各纽CIK／NK细胞上CD69的表达以及培养体系中CD4^＋CD25^＋细胞量比的变化。结果显示：加入MSC的实验各组CB-CIK细胞和NK细胞上表达的CD69比例均显著低于对照组（P值均〈0．001）．Transwell组中的CIK和NK细胞上表达的CD69,在MSC的高浓度组（1：20组）均显著低于低浓度组（1：50组和1：100组）,其中CIK细胞组间的P值分别为0．046、0．020;NK细胞组间的P值均为0．000。mixture组中不同比例组问CIK细胞上表达的CD69无显著性差异,而NK细胞上CD69的表达在MSC的高浓度组（1：20组）均显著低于低浓度组（1：50组和1：100组）。加入MSC的CB—CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋细胞的量比不论在Transwell还是mixture组中均显著高于对照组（P值均〈0．01）;在Transwell组中．CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋细胞的量比在1：20组、1：50组均显著高于1：100组;在mixture各组中,CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋T调节细胞的量比均有显著性差异。MSC的高浓度组（1：20组）,CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋细胞量比在mixture组显著高于Transwell组;而在MSC的低浓度组（1：50纽和1：100组）,2纽体系中的C04^＋CD25^＋细胞量比无显著性差异。结论：MSC能以直接接触或间接作用的方式抑制异基因CIK／NK细胞的活化,这可能与MSC能上调培养体系中的CD4^＋CD25^＋Treg细胞量比有关,且这种作用与MSC的数量呈浓度依赖关系。     

大鼠皮肤的冷冻干燥保存

背景:细胞干燥保存的研究报道较多,组织器官是否适用于干燥保存,尚缺乏证据.目的:用海藻糖作为干燥保护剂,优化海藻糖载入大鼠皮肤的条件,探索皮肤干燥保存的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-11在西北大学生命科学学院组织工程实验室完成.材料:体质量150 g左右成年SD大鼠.海藻糖由Sigma公司提供.方法:通过控制海藻糖浓度(50,300,500,800,1 000 mmol/L)、负载时间(0.5,4,7,9 h)和温度[4℃、4～37℃(相转变)和37℃],优化海藻糖导入大鼠皮肤的条件.将负载海藻糖的皮肤置于含100 g/L二甲基亚砜的DMEM冷冻液中孵育,程序冷冻仪以1℃/min的速率降温至-80℃后移入冷冻干燥机中进行冻干.将冻干皮肤水化复苏后分别用双醋酸羧基荧光素(CFDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测皮肤活性,并以新鲜和甲醛固定皮肤的吸光度值作为阳性和阴性对照.以苏木精-伊红染色和观察皮肤组织结构,并进行自体移植.主要观察指标:海藻糖在不同加载浓度、孵育温度和时间载入大鼠皮肤的情况.冻干皮肤水化后的形态学、组织学变化及其自体移植后存活情况.结果:海藻糖浓度小于800 mmol/L,皮肤的海藻糖载入量随海藻糖浓度的升高而明显增(P<0.05),浓度大于800 mmol/L,海藻糖载入量差异不显著.孵育温度为37℃组和相转变组皮肤海藻糖载入量明显高于4℃组(P<0.05),相转变组与37℃组差异无统计学意义.皮肤孵育4,7,9 h的海藻糖载入量明显高于孵育0.5 h的载入量(P<0.05),孵育时间为4,7,9 h之间的海藻糖载入量差异不显著,但孵育7 h后皮肤的海藻糖载入量不再增加.实验以海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h为优化的负载条件处理大鼠皮肤.冻干皮肤玻璃化状态良好,呈半透明状.水化后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽,组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织无差别.冷冻干燥皮肤的活性明显高于甲醛固定的大鼠皮肤(P<0.05).冻干保存的皮肤水化后移植回自体大鼠,可存活长达13 d.结论:海藻糖可作为干燥保护剂进行大鼠皮肤冷冻干燥保存,海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h是海藻糖载入大鼠皮肤的最佳条件.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞及其内向整流钾电流特征

[目的]体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞并探讨其内向整流钾电流(Ik1)特征.[方法]采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法鉴定诱导细胞,并采用全细胞膜片钳技术检测Ik1表达.[结果]诱导后细胞体积较诱导前增大,呈长梭形.14 d后细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致.免疫细胞化学染色显示Desmin、αt-sarcomeric actin和心肌特异性cTnI呈阳性反应,RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达.诱导细胞Ik1表达呈明显的不均一性,部分细胞Ik1与正常心室肌细胞相似,但Ik1电流密度总体上低于正常心室肌细胞.[结论]5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化;诱导细胞Ik1表达不均一性提示可能有致心律失常潜能.     

流式细胞仪快速优化大鼠原代培养肝细胞基因转染

【目的】用流式细胞仪(FCM)快速检测外源性血管内皮生长因子基因(VEGF基因)在大鼠原代培养肝细胞转染表达，根据结果优化其转染表达条件。【方法】以加强型黄色荧光素蛋白(EYFP)为标记，用FCM快速检测重组质粒pIRES-EYFP／VEGF121在大鼠原代培养肝细胞中转染表达，根据结果优化pIRES-EYFP／VEGF121转染表达条件。【结果】pIRES-EYFP／VEGF121得以成功构建，并转染大鼠原代培养肝细胞；优化的转染表达条件：在细胞数密度O．1xl0^6／mL，质粒孵育时间30min，质粒与脂质体混合物孵育时间15min，质粒与脂质体比例为1：1O，转染时间2h，NAIR-1作转染培养液时，转染效率达17．5％。【结论】以EYFP为标记，FCM可简便快捷地检测并优化外源性VEGF基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达，可为研究VEGF基因修饰大鼠原代培养肝细胞移植和肝基因治疗打基础。