人干细胞生长因子cDNA克隆、表达和纯化及其造血种属特异性

人干细胞生长因子（human stem cell growth factor，hSCGF）是一种早期造血调控因子。已知人干细胞生长因子具有两种形式，包括全长分子hSCGF以及在Ca^2＋依赖糖识别结构域（calcium-dependent carbohydrate recognition domain，CRD）内缺失78氨基酸的截短型分子hSCGFβ。hSCGFβ的造血刺激活性具有严格的种属特异性。本研究目的在于探讨hSCGF能否协同刺激小鼠彬单系祖细胞增殖。为克服hSCGF的cDNAGC含量较高的困难，本研究以两步PCR的方法从人胎肝cDNA文库（Clontech）中成功克隆hSCGFcDNA，进而将hSCGF成熟肽编码序列亚克隆于原核表达载体pGEX4T-2中，融合表达。研究结果表明，通过低温诱导（28℃）。重组表达产物主要以可溶蛋白的形式存在于裂解上清中，利用亲和层析纯化融合表达蛋白。对重组蛋白的造血刺激活性分析表明，不同于截短型分子hSCGFβ。全长分子hSCGF能够刺激小鼠骨髓彬单系造血祖细胞增殖。结论：hSCGFCRD不直接结合受体。可能具有其他生物学功能。     

基于白蛋白的纳米递送系统在肿瘤诊断治疗领域中的研究进展

 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一群存在于骨髓、脂肪、骨实质、胎盘及骨骼肌等多种组织中的干细胞，具有向骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化的功能^[1]。也有资料表明，MSC分化能力接近于胚胎干细胞，可分化为肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元样细胞和肝细胞^[2-5]。体外实验证实，MSC本身并不引起异体淋巴细胞活化，但可抑制由丝裂原或异体淋巴细胞激活的T、B淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞的增殖^[6-8]，抑制树突状细胞的发育与成熟^[9]。因此，MSC在造血干细胞移植、器官移植、骨和软骨组织修复、心肌梗死和肝脏损伤的治疗中具有潜在的应用价值，某些治疗措施已经进入临床试验阶段。目前，美国FDA已经批准的有关MSC治疗的临床试验包括：⑴异体MSC静脉输注治疗异基因骨髓移植中的移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）；⑵自体MSC静脉输注治疗Crohn病；⑶自体MSC局部应用治疗牙周疾病；⑷异体MSC静脉输注治疗心肌梗死；⑸异体MSC修复半月板；⑹粒细胞集落刺激因子（G-CSF）动员MSC治疗心肌梗死等。在国内，多家单位已经将自体或异体MSC试用于临床，以预防或治疗GVHD、心肌梗死、骨或软骨缺损和股骨头坏死等^[10-13]。然而，有关MSC临床应用的一些基本问题尚不清楚，盲目开展临床试验是不妥当的。本文就相关问题进行综述和讨论。...     

萤火虫荧光素酶报告基因重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的构建含萤火虫荧光素酶报告基因的逆转录病毒载体,为进一步研究生物发光活体动物体内光学成像奠定基础。方法利用重组DNA技术,将荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic双酶切得到的目的基因fluc+亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN中,重组质粒pL(fluc)SN在脂质体介导下乒乓转染GP+E86和PA317包装细胞,G418筛选,直至出现抗性克隆。扩大培养,测定病毒滴度,并检测荧光素酶活性。结果经限制性酶切分析鉴定,载体插入基因大小、位置均正确,并用GP+E86和PA317细胞进行包装、病毒滴度测定、筛选,建立具有较高滴度的重组逆转录病毒fluc细胞系,该细胞可高效表达荧光素酶。结论成功构建了重组质粒pL(fluc)SN,为标识干细胞进行基础研究提供了一种检测方法和平台。     

应用SCF＋IL—2等细胞因子从脐血CD34^＋细胞扩增T细胞

肿瘤和艾滋病（ＡＩＤＳ）的基因治疗或免疫治疗的研究需要大量的Ｔ细胞克隆。尽管Ｔ细胞来源于ＣＤ３４＾＋细胞，但由于需要胸腺组织的参与，使其在体外扩增大量细胞克隆非常困难。本研究用脐血单个核细胞作为辅助细胞，在ＳＣＦ＋ＩＬ－２等细胞因了的作用下，人脐血ＣＤ３４＾＋在此培养条件下，不断产生ＣＤ４＾＋或ＣＤ８＾＋Ｔ细胞至少持续３周。在培养扩增过程中，发现ＣＤ４＾＋和ＣＤ８＾＋Ｔ细胞的比例有一个不断变化的动     

脊髓损伤中少突胶质细胞的病理学研究进展

少突胶质细胞(OL)经过增殖、迁移、分化、髓鞘化,最终形成轴突绝缘髓鞘。髓鞘形成障碍或变性,会影响中枢神经系统(CNS)信号传导,造成信号传导延迟或中断。越来越多的证据表明,OL参与脊髓损伤(SCI)的病理过程并发挥重要作用。理解OL在SCI中病理变化及机制,对认识与修复SCI具有非常重要的意义。本文将综述SCI中OL病理学方面的研究进展。     

骨髓间充质干细胞条件培养液对H_2O_2损伤大鼠心肌细胞的保护

背景：间充质干细胞移植可以降低心肌梗死面积、改善心功能,目前多数认为间充质干细胞分泌生物因子起主要作用。目的：观察骨髓间充质干细胞条件培养液对过氧化氢诱导新生大鼠心肌细胞凋亡的影响。方法：分离培养并鉴定骨髓间充质干细胞和新生大鼠心肌细胞,制作骨髓间充质干细胞条件培养液以及过氧化氢损伤新生大鼠心肌细胞模型,实验分为4组：对照组、模型组、骨髓间充质干细胞条件培养液组以及骨髓间充质干细胞条件培养液＋PI3K抑制剂处理组。以ELISA检测乳酸脱氢酶活性和流式细胞术检测细胞凋亡率来评估新生大鼠心肌细胞损伤程度。结果与结论：模型组乳酸脱氢酶活性明显高于其余各组（P〈0.01）,同时骨髓间充质干细胞条件培养液＋抑制剂组也高于骨髓间充质干细胞条件培养液组（P〈0.01）;骨髓间充质干细胞条件培养液组细胞凋亡率低于与骨髓间充质干细胞条件培养液＋抑制剂组（P〈0.01）,并且都低于与模型组（P〈0.01）。证明了骨髓间充质干细胞条件培养液抑制了过氧化氢诱导的新生大鼠心肌细胞凋亡,该作用部分是通过PI3K途径发挥的。     

利用单个核细胞培养扩增NK细胞体系探索

目的:探寻一种通过单个核细胞使自然杀伤(NK)细胞在体外培养扩增的新方法,为NK细胞免疫治疗奠定实验基础。方法:收集3份健康足月孕妇的脐带血,应用密度梯度法分离单个核细胞(PBMNC),每份单个核细胞样本均分为CD16 m Ab、CD3 m Ab和CD16 m Ab+CD3 m Ab处理3组。使用含自体血浆、重组人IL-2、IL-15和IL-21的无血清培养液,在相同条件下培养扩增14 d,计算其扩增倍数。应用流式细胞术测定CD56~+CD3~-比例;以K562细胞为靶细胞,应用MTT法测定所培养的NK细胞在不同效靶比条件下的杀伤率。结果:培养14 d后,CD16m Ab、CD3 m Ab和CD16 m Ab+CD3 m Ab组细胞总数分别扩增45.71±5.54、87.41±19.77和51.84±4.88倍,在CD3 m Ab组显著高于其它2组(P0.05)。培养前CD56~+CD3~-细胞比例为0.1663±0.0201,经培养扩增14 d后CD16 m Ab、CD3 m Ab和CD16 m Ab+CD3 m Ab组CD56~+CD3~-细胞比例分别为0.8167±0.0500、0.8077±0.0589和0.8077±0.0273,3组之间无显著性差别。培养14 d后,MTT法检测显示,在效靶比为1∶1、5∶1和10∶1时3组杀伤效率均无显著差异(P0.05)。结论:使用抗CD3 m Ab及IL-2,IL-15和IL-21培养单个核细胞,可获得高纯度和高杀伤活性的NK细胞。本研究为NK细胞的治疗提供了一个简单有效的方法。     

大规模间充质干细胞培养技术评估

目的通过对间充质干细胞体外培养技术的系统评价,为制定间充质干细胞临床研究的管理规定提供相关信息。方法采用文献调研和专家讨论的方式对间充质干细胞的细胞来源、分离方法、培养技术、保存、安全性、质量监控等方面进行评估。结果①来源：间充质干细胞可以来源于骨髓、脂肪、脐带、脐带血、胎盘等众多组织。②分离方法：常用密度梯度分离法、流式分选法和直接培养法,通过其贴壁生长的特性进一步纯化。③培养方式：原始间充质干细胞数量很少,但经过2~3周的体外扩增培养,可以满足临床使用的数量级,间充质干细胞培养体系有开放式平面培养和全封闭式生物反应器培养方式,要求在 GMP 条件下的洁净实验室内进行。④培养基：间充质干细胞培养基主要有含胎牛血清培养基、人 AB 血清或血小板裂解物替代胎牛血清的培养基以及成分确定的无血清培养基,临床使用应尽量避免使用异种血清。⑤细胞冻存：间充质干细胞可以深低温保存而不改变生物学特性,低温保护剂有二甲基亚砜、甘油、羟乙基淀粉等。⑥安全性：体外培养的间充质干细胞在8~10代以内,基因型稳定,应用于临床是安全的。超过10代以后,风险增加。目前尚未发现培养的间充质干细胞与新生肿瘤有直接关系。⑦间充质干细胞质量监控标准包括供体筛选、细胞微生物安全检测（细菌、真菌、支原体）,细胞功能鉴定（诱导分化、流式鉴定）,基因组不稳定性或细胞衰老判定等。结论间充质干细胞来源广泛,取材方便,其分离和培养技术成熟。可以在体外实现大规模的培养,满足临床使用的数量级,并且可以实现长期保存而不改变生物学特性。间充质干细胞体外培养技术还缺乏相应的标准规范,更适用于临床的无血清培养基和冻存保护剂还有待于进一步的研究与论证。     

脐带间充质干细胞鞘内注射治疗脊髓小脑性共济失调

背景：脊髓小脑性共济失调是以小脑共济运动障碍为主要临床表现的遗传性变性疾病,迄今为止缺乏有效的药物治疗。目的：观察脐带间充质干细胞鞘内注射治疗脊髓小脑性共济失调的临床疗效。方法：38例脊髓小脑性共济失调患者给予脐带间充质干细胞鞘内注射治疗,1×106/(kg?次),1次/周,4次为1个疗程。38例患者共接受52个疗程治疗,其中27例接受1个疗程治疗,8例接受2个疗程,3例接受3个疗程。采用世界神经病联合会国际合作共济失调量表(ICARS)对患者治疗前后神经功能进行评定,分值越高表示神经功能缺损越严重,采用日常生活能力量表(ADL)对患者治疗前后的日常生活能力量进行评估,分值越低,日常生活能力越强。治疗后对患者进行随访。结果与结论：38例脊髓小脑性共济失调患者52个疗程治疗总有效率为84.6%。治疗结束1个月与治疗前比较 ICARS及ADL评分均明显降低(P<0.01)。有效患者行走不稳、站立不稳、运动迟缓、上肢精细动作障碍、书写困难、构音障碍、眼球运动障碍等临床症状得到改善。治疗后常见的不良反应有头晕(1例),腰痛(2例),头痛(1例),发热(2例),均在1-3 d内消失。在中位随访39个月(11-59个月)治疗过程中,无治疗相关的不良反应发生。有效患者疾病稳定时间在1-19个月,平均(5.95±4.84)个月。结果表明脐带间充质干细胞鞘内注射治疗是安全的,可在一定时间内一定程度上改善脊髓小脑性共济失调患者的临床症状,延缓疾病进展,多疗程治疗有助于多数患者神经功能的进一步改善。     

人脐静脉内皮细胞内化膜微粒通路的初步探索

目的:探讨人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)内化骨髓间充质干细胞(MSC)来源膜微粒(microparticles,MP)的可能途径。方法:将人骨髓MSC经低氧低营养诱导后收集上清,超速离心机分离提取MP,电子显微镜鉴定其形态及大小;流式细胞术检测MP表面标记物及磷脂酰丝氨酸(PS)的表达;细胞免疫荧光技术观察HUVEC是否表达PS受体(PSR)。将Di I标记的MP与HUVEC共孵育,体系中加入PSR封闭性抗体,在共聚焦显微镜下观察MP的内化过程。结果:MSC在低氧低营养条件下诱导产生的膜微粒高表达PS,内皮细胞表面表达PSR。MP可快速进入内皮细胞,并主要分布于细胞核周围胞浆。抗体封闭内皮细胞PSR后,HUVEC内化MP的过程明显受抑,抑制率达80%以上。结论:MSC-MP表面的PS与HUVEC表面PSR的特异性结合,是MP内化的关键环节。