Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow

Objective To study the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow. Methods A culture of mesenchymal stem cells was initiated from bone marrow low-density mononuclear cells separated by Percoll Centrifugation and maintained in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% selected fetal calf serum. Cell growth pattern and its responses to cytokines were evaluated by trypan blue exclusion and MTT test, respectively. Cell cycle and surface antigenic features were analyzed by flow cytometry technique. Cytochemistry characteristics of MSCs were determined.Results Easy-handling methods to isolate and culture expand MSCs were developed in this study. MSCs were unique in their phenotypes. They were positive for CD29, CD44, CD166, and negative for CD34, CD45, HLA-DR and Ulex europaeus. Cytochemistry evaluation showed that MSCs were homogeneously positive for acid α-naphthl acetate esterase (ANAE), glycogen (periodic acid Schiff reaction, PAS), and negative for acid phosphatase (ACP) and the Sudan black reaction (SB). Around 5% of them were positive for alkaline phosphatase (ALP). The cells had a population doubling time of 30 hours and cell cycle analysis showed that approximately 10% of them were in S phase. MSCs grew at significantly different rates when incubated in the presence of various recombinant human cytokines, of which interferon γ, tumor necrosis factor α, stem cell factor and insulin-like growth factor promoted the proliferation of MSCs dramatically, while others tested had no effects on cell growth. Conclusions MSCs are a homogenous population of cells that have unique growth, phenotypical and cytochemical characteristics. Furthermore, the diverse responses of MSCs to different cytokines provide a clue for the selection of optimal expansion and maintenance of MSCs.     

肝细胞生长因子修饰兔骨髓间充质干细胞的实验研究

目的研究重组腺病毒肝细胞生长因子对兔骨髓间充质干细胞的转染率及转染后细胞的分化特点。方法获取骨髓间充质干细胞并传代培养、鉴定,以MOI=150的重组腺病毒肝细胞生长因子（Ad—HGF）对其进行修饰,以Ad—GFP检测病毒72h转染率,观察转染后细胞的成骨及成脂分化特点。结果Ad—HGF对MSCs感染效率为99．78％,成骨及成脂诱导14d后可见典型分化。结论以Ad—HGF对MSCs进行感染效果良好,可成为缺血性骨坏死较为有效的治疗手段。     

人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)是一群存在于骨髓腔内的能向骨、软骨、脂肪、肌肉和基质细胞等分化的细胞。最近的骨髓移植动物模型研究显示 ,在体内骨髓细胞具有形成神经元的能力[1 ,2 ] 。与造血细胞相同 ,骨髓中的间充质干细胞也具有可移植性[3] 。因此 ,骨髓移植后形成神经元的细胞可能来源于间充质干细胞。为验证此推测 ,我们进行了如下实验。材料与方法肝素抗凝骨髓取材于异基因骨髓移植过程中正常献髓者。间充质干细胞分离、纯化和体外培养按我们以前报道的方法进行[4] 。形成致密贴壁层的间充质干细胞用 0 .0 5 %…     

大鼠骨髓mMSC和RS细胞肝组织内注射对肝硬化大鼠肝功能及肝脏病变的改善作用观察

目的 观察肝组织内注射大鼠成熟间充质干细胞(mature MSC,mMSC)与快速自我更新细胞(rapidly self-renewing cell,RS细胞)对肝硬化大鼠的治疗效果.方法 取2周龄Wistar雄性大鼠1只,处死后取胫骨、股骨,分离、培养、鉴定大鼠骨髓mMSC、RS细胞.取36只Wistar大鼠制备肝硬...     

单倍体相合造血干细胞移植后早期T细胞数量及功能初步分析

为探讨单倍体相合造血干细胞移植（haploidentical-HSCT,hiHSCT）后早期T细胞免疫重建特点,采集22例患者移植后6个月内不同时间点的外周血,应用流式细胞术检测其T细胞亚群,以评价胸腺输出功能和T细胞数量的变化规律,使用Immuknow方法测定CD4＋T细胞内ATP含量,以评估重建T细胞的功能。结果表明：移植前CD3＋细胞数为833.75±359.84/μl,移植后1个月为318.87±266.71/μl,3个月为1006.76±512.32/μl,6个月升至1296.38±958.77/μl。移植前CD4＋细胞数为336.99±211.12/μl,移植后1个月为45.89±44.21/μl,3个月时平均值为142.97±114.85/μl,6个月为181.78±120.61/μl;移植前CD8＋细胞平均值为430.21±159.48/μl,移植后1个月230.44±195.89/μl,3个月为621.64±318.83/μl,6个月为823.077±633.55/μl;移植前CD4＋CD45RO＋记忆T细胞平均值为227.44±73.34/μl,移植后1个月为43.47±43.40/μl,3个月为138.69±110.17/μl,6个月为147.73±82.94/μl;移植前CD8＋CD45RO＋记忆T细胞数为212.70±98.48/μl,移植后1个月为184.76±168.65/μl,3个月为445.90±252.50/μl,6个月为519.80±475.53/μl;移植前CD4＋CD45RA＋CD62L＋初始T细胞数为68.94±59.74/μl,移植后1个月为2.44±2.93/μl,3个月为3.14±3.48/μl,6个月为23.22±38.38/μl;移植前CD8＋CD45RA＋CD62L＋初始T细胞为124.82±60.95/μl,移植后1个月为19.37±17.71/μl,3个月为76.63±50.85/μl,6个月为114.49±174.29/μl。Immuknow结果显示,hiHSCT后1个月CD4＋T细胞内ATP含量降至210.19±119.37 ng/ml,其后逐渐恢复,在移植后3个月左右恢复至280.62±110.03 ng/ml,在移植后6个月左右升至357.28±76.18 ng/ml。结论：hiHSCT后早期T淋巴细胞重建以CD8阳性的记忆T细胞扩增为主,胸腺输出功能较差,但受者T细胞功能在移植后3个月时达到正常水平。     

间充质干细胞分泌TGF-β1抑制异体T细胞反应性

为探讨骨髓间充质干细胞（MSC）诱导异体T细胞反应性下降的机制。应用流式细胞术检测了异体T细胞与骨髓间充质干细胞共培养前后CD4，CD8，CD25和CD28等的变化，同时应用RT-PCR测定MSC是否表达IL-4，IFN-γ和TGF-β1等细胞因子，并用ELISA的方法验证培养上清中蛋白的存在。结果显示，异体T细胞与MSC共培养后，CD8^ 细胞增多，CD25^ 细胞减少，RT-PCR检测结果证明MSC高表达TGF-β1基因，但不表达IL-4和IFN-γ基因，ELISA证实MSC培养上清存在TGF-β1蛋白，其72小时分泌量约为1ng/ml。结论：骨髓MSC在体外可使异体T细胞对异体抗原的反应性减低，这种作用体现在细胞亚群的改变与MSC分泌TGF-β1有关，这一研究结果为预防HLA不相同合骨髓移植中GVHD的发生提出一条新的思路。     

磷酰肌醇-3激酶途径在CML细胞增殖和抗凋亡中的作用

为探讨磷酰肌醇-3激酶(PI3K)通路在CML细胞增殖和抗凋亡中的作用,作者应用沃氏篮酶素(Wortmannin,WT)特异性地抑制PI3K激酶活性,经细胞生长曲线测定、半固体集落培养和流式细胞膜联蛋白 V(Annexin V)标记技术,观察了K562和NB4细胞增殖能力与凋亡抗性的改变。结果:WT显著抑制K562细胞增殖能力,24,48及72小时增殖抑制率分别为23.13％。45.17％和60.42％,集落形成抑制率为53.91％(均P<0.05),而对NB4细胞的增生无明显影响;WT可促进由Vp16诱导的K562细胞凋亡。凋亡指数提高1.49倍,NB4细胞的凋亡指数无显著改变。上述结果证明了PI3K在CML细胞增殖和抗凋亡中占重要地位。     

间充质干细胞临床试验中的问题及其解决策略

人间充质干细胞（mesenchymal s temcells,MSCs）具有多向分化特性、免疫调节作用及体外分离培养扩增操作简便,因此国内外多家单位均开展了MSC临床试验,以预防和治疗异基因骨髓移植后移植物抗宿主病,修复骨和软骨损伤,治疗心肌梗塞和肝脏损伤等多种疾病。然而,越来越多的资料提示,在制订临床应用方案及具体实施过程中,必须考虑到细胞培养用动物血清蛋白的内在化、植入细胞体内存活以及分化专一性等诸多因素。本文综述了临床试验设计中宜注意的问题。     

间充质干细胞免疫调控功能研究新进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞的一种。近年来的相关研究表明,MSC具有低免疫原性,它可以通过抑制淋巴细胞的增殖、抑制抗原呈递细胞分化成熟及功能发挥、抑制CTL形成、增加调节性T细胞比例等多种途径发挥免疫调节作用。体内实验证明,MSC输注能够延长狒狒异体皮肤移植的存活时间,可减轻小鼠实验性自体免疫性脑脊髓膜炎。在临床上,MSC应用于异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的预防和治疗效果显著。本文对MSC的免疫学特性及其在体内外试验中发挥的免疫调控功能的研究进展进行了综述。     

组织块法分离培养小鼠脾脏间充质干细胞

目的通过组织块培养法,建立一种高效可靠的小鼠脾脏间充质干细胞分离扩增策略。方法无菌条件下取小鼠脾脏组织充分碾碎,使用胶原酶消化获得的脾脏基质组织,将消化后的组织块种于培养瓶中,观察从组织块中迁移出的细胞形态,采用流式细胞术分析其表型,并将其做成骨和成脂肪诱导分化。结果消化后的脾脏组织块中迁移迁移出大量梭形纤维样细胞,流式细胞术检测结果表明,该种细胞高表达CD29、CD44、Sca-1和CD105,低表达CD11b、CD34、CD45和Ia。多向分化实验结果表明:小鼠脾脏基质组织中迁移出的细胞具有较好的成脂肪和成骨分化能力。结论组织块法可以分离培养出小鼠脾脏间充质干细胞,所获得的细胞纯度高,分化能力强,为开展相关研究提供了良好的细胞模型。