小鼠大脑中动脉栓塞脑局部缺血模型及其评价方法

目的通过比较客观和可靠的神经行为学评分,以及脑梗死体积和水肿率的计算,评价小鼠大脑中动脉阻塞(middlecerebral artery occlusion,MCAO)局部缺血模型的成功率和可靠性。方法线栓法致小鼠MCAO制备大脑局部缺血模型,应用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色和神经行为学评分等方法,计算脑梗死体积、水肿率并观察行为学指标。结果TTC染色证实,MCAO可诱发明显的小鼠脑局灶性缺血,手术成功率约为90.8%,其中以皮质缺血为主,少数为单纯海马和丘脑缺血;脑局部缺血损伤可引起小鼠神经行为学的显著改变,即总体神经行为学评分增加;同时,脑梗死体积约占全脑体积的35%,分析结果准确和稳定。结论本研究成功地建立了MCAO致小鼠脑局部缺血的模型,且有较高的成功率(90.8%);同时所用评价神经功能损伤和脑梗死体积方法具有较高的可靠性。     

应用载体介导的RNA干扰技术抑制Nurr1基因在PT67细胞中的表达

本研究应用载体介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异地干扰孤儿核受体1(nuclear related factor1,Nurr1)基因的表达,以建立稳定的RNAi技术及用于下一步的Nurr1基因治疗研究。我们筛选了四对Nurr1基因的特异性序列shRNA(short hairpin RNA),构建相应的载体(psilencerTM3.1-H1neo shRNA1,2,3,4)。分别将这4种质粒瞬时转染入已转染了逆转录病毒质粒pLNCX2-Nurr1并稳定表达Nurr1基因的PT67细胞中。在转染后24、48和72h分别采用免疫荧光、免疫组化、免疫印迹以及Real-time PCR的方法检测细胞中Nurrl蛋白及基因的表达水平。结果显示,转染psilencerTM3.1-H1neo shRNA2、3号24h和48h后,经免疫荧光和免疫组化检测,Nurr1在PT67细胞中表达显著降低;免疫印迹结果也显示,Nurr1蛋白量明显低于阴性对照组。psilencerTM3.1-H1neo shRNA1、4对Nurr1蛋白表达没有明显影响。Real-time PCR相对定量结果也同样证实2、3号转染后Nurr1基因表达的干扰效果明显,而1、4号结果相对较弱。通过本实验,我们筛选出了两段Nurr1特异性siRNA序列,且干扰效果在转染后24h至48h时效果最为明显。     

脑卒中合并糖尿病患者营养风险筛查研究现状

脑卒中和糖尿病都是营养相关性疾病,脑卒中后的营养教育和管理是治疗中的重要组成部分。脑卒中合并糖尿病患者的营养管理,首先应建立营养风险评估体系。现综述脑卒中合并糖尿病患者营养风险评估的研究现状,旨在为脑卒中合并糖尿病患者的营养管理提供依据。     

四物汤对血管性痴呆大鼠的认知功能及脑组织中AchE、SOD、GSH-Px活性的影响

目的:研究四物汤对血管性痴呆大鼠的认知功能及脑组织中乙酰胆碱酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的影响。方法:反复夹闭大鼠双侧颈总动脉结合腹腔注射硝普钠降低血压的方法制备拟血管性痴呆大鼠模型,观察四物汤对大鼠的学习记忆能力及脑组织中AchE、SOD和GSH-Px活性的影响。结果:四物汤能提高血管性痴呆鼠的学习记忆能力;同时可提高SOD和GHS-Px活性,降低AchE的活性。结论:改善胆碱能神经功能、减轻自由基损伤可能是四物汤改善血管性痴呆的机制之一。     

α-synuclein-pEGFP真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

为了构建 α-synuclein-p EGFP真核表达载体 ,检测其在 SH-SY5 Y细胞内的表达 ,本研究应用下述方法 :PCR扩增 α-synuclein基因并消除终止密码子 ;PCR产物连入 p GEM T-easy载体 ,经测序确认无误后 ,亚克隆入 p EGFP-N1,构建α-synucle-in-p EGF P真核表达载体 ;Lipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ;荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,原位杂交和免疫荧光细胞化学法检测α-synuclein m RNA及其蛋白表达。结果显示 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,可在细胞内观察到报告基因和目的基因的表达产物。结论 :α-synuclein-p EGFP真核表达载体构建成功 ,并可在细胞内表达。本工作为今后动态观察研究α-synu-clein致 Parkinson病多巴胺能神经细胞损伤机制奠定基础     

大鼠Hes1基因真核表达载体的构建及瞬时表达在神经前体细胞分化中的作用

目的 探讨Hes1基因高表达对神经前体细胞分化的影响. 方法从大鼠脑组织中提取总BNA,用RT-PCR方法获得Hes1基因的全长cDNA,插入pGEM-T-Easy克隆载体中进行序列测定,测序正确后将其亚克隆至表达载体pCDNA3.1,用脂质体将重组质粒转染原代培养的神经前体细胞,经G418筛选获得抗性细胞克隆,用RT-PCR方法鉴定Hes1基因在神经前体细胞基因组中的存在,实时荧光定量PCR检测Hes1基因在转染细胞中的过表达情况. 结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定,证实目的 基因已插入重组质粒,RT-PCR证明,经G418筛选得到的转基因神经前体细胞克隆的基因组DNA中存在Hes1基因;实时荧光定量PCR进一步证明,转基因神经前体细胞Hes1基因的mRNA高表达. 结论 构建了大鼠Hes1基因的真核表达载体,获得了高表达Hes1基因的神经前体细胞克隆.Hes1基因高表达可抑制神经前体细胞Ngn1的表达,并促进神经前体细胞向神经胶质细胞的分化.     

人胰岛素样生长因子-1基因的克隆、表达和活性检测

目的 克隆人胰岛素样生长因子Ⅰ型(hIGF-1)，构建真核表达载体并进行表达及活性检测，为IGF-1基因治疗糖尿病奠定基础。方法 提取胎儿肝脏总RNA，RT-PCR法扩增IGF-1cDNA片段，重组于pUCM-T载体，测序正确后构建表达载体，转染猴肾成纤维细胞系COS-7，用原位杂交和免疫组织化学检测表达，收集培养上清以胰岛素刺激释放实验进行活性测定。结果 扩增得到710bp带有Kozak序列的IGF-1cDNA片段；成功构建了真核表达载体pCI-neo／hIGF-1；IGF-1在COS-7细胞得到了表达，并具有刺激胰岛素分泌的活性。结论 新构建的载体pCI-neo／hIGF-1能在COS-7细胞中表达、分泌，且所分泌的IGF-1具有生物活性。     

内源性Nurrl对胚胎中脑及前脑前体细胞体外分化的诱导作用

目的：多巴胺神经元的发育是人们较为关注的问题，目前发现的蛋白可能在其发育机制中起着重要作用，研究内源性Nurrl基因表达变化对体外培养大鼠胚胎神经前体细胞分化的诱导作用。方法：实验于2003-05／2004-08在首都医科大学北京神经科学研究所完成；分离13．5d大鼠胚胎中脑及前脑神经前体细胞并进行体外培养，培养基中加入视黄酸及毛喉素诱导3d，采用RT-PCR，Western Blot及免疫荧光染色的方法观察Nurrl表达的变化及细胞分化；同时，用反义寡核苷酸转染技术阻断细胞Nurrl表达后再进行诱导，并进行同样观察。结果：视黄酸及毛喉素可诱导前体细胞的Nurrl表达，增加约60％，中脑来源神经前体细胞中(tyrosine hydrixylase，TH)阳性细胞占β-tublin-Ⅲ阳性细胞的比例由原来的(5．32&;#177;1．20)％增至(9．01&;#177;3．20)％。前脑来源神经前体细胞中TH阳性细胞占β-tublin-Ⅲ阳性细胞的比例由原来的(1．27&;#177;1．20)％增至(5．01&;#177;1．50)％。Nurrl反义寡核苷酸作用12h后前体细胞的Nurrl表达被阻断，至72h后重新表达。Nurrl被阻断后，只有少量的前体细胞被诱导为TH阳性细胞。结论：内源性Nurrl的过表达可促进胚胎神经前体细胞向多巴胺能神经元分化。     

干性记忆型T细胞及其在抗肿瘤研究中的进展

正伴随CAR-T细胞疗法获得FDA批准正式上市以来,足以改变癌症治疗模式的过继免疫治疗(AIT)成为人们持续关注的热点。AIT目前大多采用分化终末期的效应T细胞,而且其疗效与过继转移T细胞的数量有关。研究表明中晚期T细胞回输后,其扩增及存活能力均不如早期T细胞,例如Klebanoff等~([1])观察了中心记忆型T细胞(TCM)和效应型T细胞(TEM)分别输注于接种肿瘤细胞的小鼠模型,发现在体内TCM比TEM具有更持久的存活时长和更好的抗肿瘤效果。