成年大鼠及猴骨髓基质细胞的体外培养及向神经元的分化诱导

为了探讨成年动物骨髓基质细胞的体外培养和神经元诱导及其不同培养时程对外源基因的转染率,本实验采用直接和间接两种方法分离、培养成年大鼠和猴的骨髓基质细胞。在体外进行神经元诱导,用免疫细胞化学方法进行鉴定;用携带酪氨酸羟化酶基因的逆转录病毒载体转染体外培养第1～10代大鼠骨髓基质细胞,经免疫细胞化学鉴定并计算转染率。结果显示,成年大鼠和猴骨髓基质细胞以未分化状态至少可持续培养20余代,部分细胞表达干细胞的标志蛋白nestin,经BrdU孵育后呈BrdU抗体免疫阳性;经诱导后细胞具有典型的神经元形态,表达神经元的特异性蛋白NeuN;培养第3代至6代的骨髓基质细胞对外源性基因的转染效率较其他时程明显增高。实验结果说明,骨髓基质细胞可以在体外培养并被诱导成为神经元,它还可携带外源性治疗基因。     

骨髓间充质干细胞基因工程改造方法的比较

目的:对脂质体介导、反转录病毒载体介导、腺相关病毒载体介导这3种常用的基因转染方法进行比较,寻找一种适合于骨髓间充质干细胞的基因转移方法。方法:实验于2004-10/2005-06在首都医科大学北京神经科学研究所完成。①在脂质体介导下,将增强的绿色荧光蛋白基因导入骨髓间充质干细胞,然后通过G418抗性筛选,观察转染效率。②反转录病毒介导的基因转染,首先利用LipofectAMINETM 2000转染包装细胞系PT67,获得重组反转录病毒上清,然后用病毒上清直接感染骨髓间充质干细胞。转染后的细胞同样用G418筛选,得到阳性克隆后进行定点消化、扩增。③在腺相关病毒介导的基因转染过程中,首先通过磷酸钙沉淀法转染包装细胞系HEK293,得到重组AAV-LacZ病毒颗粒直接感染骨髓间充质干细胞,1周后进行β-gal染色,计算转染效率。结果:①脂质体介导的基因转染24h后在荧光显微镜下观察,可见少量细胞呈现绿色荧光蛋白阳性,阳性率大约为5%。抗生素筛选3周后细胞全部死亡,经过多次试验均未得到阳性细胞克隆。②反转录病毒感染后,在荧光显微镜下观察可见少量骨髓间充质干细胞表达增强的绿色荧光蛋白。当加入G418筛选后,大量细胞死亡,1周后仅有极少数细胞存活。继续培养3～4周后,细胞形成克隆,定点消化细胞克隆,扩增后95%的细胞表达绿色荧光蛋白。③腺相关病毒上清感染骨髓基质细胞1周后,用β-gal染色估计骨髓间充质干细胞转染效率大约为75%。但传代后阳性细胞所占比例明显下降,大约2%。结论:骨髓间充质干细胞易于接受外援基因。3种基因转移方法相比:脂质体转染法转染效率最低,不适合骨髓间充质干细胞;反转录病毒载体法感染效率最高,最适用于骨髓间充质干细胞;而腺相关病毒载体法感染效率较高,但该载体系统没有抗生素筛选,所以无法使阳性细胞得到纯化和扩增,其可能更适合于体内基因直接感染。     

胰岛素样生长因子-1工程细胞在糖尿病中的治疗作用

目的 观察胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)工程细胞移植对糖尿病模型鼠的降血糖作用.方法 将hIGF-1基因克隆入pAAV腺病毒相关病毒载体,以HEK293包装细胞及病毒颗粒,HT1080细胞检测病毒滴度.将高病毒滴度的病毒上清感染骨髓基质细胞(MSCs)并植入糖尿病模型小鼠腹腔内,观察病毒感染MSCs植入对糖尿病模型小鼠血糖的影响.结果 成功构建了hIGF-1腺病毒相关病毒载体,HEK293细胞包装得到了1012滴度的病毒上清.MSCs病毒感染率达60%.稳定表达hIGF-1的MSCs腹腔移植后,可见糖尿病小鼠的血糖明显下降(P＜0.05).结论 稳定表达hIGF-1的MSCs对糖尿病动物模型有降糖作用,说明IGF-1基因可作为糖尿病基因治疗的候选基因.     

小儿上消化道出血73例治疗体会

小儿上消化道出血是危及病儿生命的严重症象之一。其原因复杂，且婴幼儿检查困难。我科１９８６年１０月至１９８８年５月收治上消化道出血病儿７３例，现分析报告如下：１临床资料１．１一般资料：７３例男４７例，女２６例，男女之比１８∶１。新生儿１９例，２个月～...     

天津市社区居民血糖状况调查

据WHO报道，全球有糖尿病病人超过1．35亿，我国有近4000万，其中2型糖尿病占95％以上。预测到2025年将增至3亿，新增病例将主要集中在中国、印支次大陆及非洲等发展中国家。由此可见，糖尿病已成为全球性重大公共卫生问题。为了解高血糖在人群中的发生状况，掌握糖尿病流行病学特点及变化趋势，采取相应的预防措施，笔者将“2002年中国居民营养与健康状况调查”天津市社区居民血糖调查结果进行了分析。     

重组PCR快速基因定点突变的技术方法

聚合酶链式反应(PCR)是由Mullis等联合研制的一种在体外快速对特定DNA序列扩增的技术[1]。本研究通过重组PCR技术对growth associated protein-43(GAP-43)基因Ser41(丝氨酸)AGC定点突变为Ala41(甘氨酸)GCC,此方法比传统的体外基因突变技术更简单、快速而且经济。1材料和方法1.1     

人AADC基因的克隆

为克隆表达人芳香族左旋氨基酸脱羧酶的基因 ,以了解此基因在多巴胺代谢过程中的作用 ,从人类胎儿黑质组织中提取总RNA ,以RT PCR方法扩增 1 4 4 2bp的cDNA片段 ,将此片段克隆于 pGEM T载体中 ,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后 ,进行全序列分析。结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致 ,得到了编码正确的人AADC的cDNA全序列。     

Ⅱ型人多巴胺受体逆转录病毒载体的构建及表达

目的构建人全长耽R基因真核表达载体,研究D2R在帕金森病（PD）中的作用和机制。方法将D,ReDNA片段克隆于pLNCX2逆转录病毒载体,转染成纤维包装细胞系PT67,G418筛选单克隆后进行传代培养,通过原位杂交、免疫组织化学和Western blot检测其表达效果。病毒上清再感染骨髓基质细胞（MSCs）,免疫荧光检测D2R基因表达率。结果成功构建了逆转录病毒表达载体pLNCX2-D2R,原位杂交证实D2R基因在PT-67表达的阳性率为80％以上,免疫组织化学检测可见其蛋白分布在胞浆和胞膜,细胞裂解后Western blot蛋白电泳可检测到约48．84kD的蛋白。经转染D2R基因的PT67细胞能分泌病毒并感染MSCs。结论逆转录病毒介导的D2R基因经PT67细胞包装后,能够产生病毒颗粒,收集含病毒颗粒的上清可进一步感染MSCs,这种经逆转录病毒介导的D2R基因可用来作针对帕金森病进行基因治疗的研究。     

ADL的系统干预对脑卒中患者运动功能的影响

脑卒中最主要的临床表现是运动障碍,随着时间的推移,其肢体功能可获得一定程度的改善和提高,但其幅度小、时间长。为此我们对脑卒中患者进行了ADL系统干预,以提高患者的运动功能。1对象与方法1.1研究对象以2008年10月至2009年11月期间在河北省唐山工人医院神经内科住院符合纳入标准的脑卒中患者100     

对脑卒中患者实施系统干预的效果研究

目的 探讨日常生活活动能力的系统干预对脑卒中患者运动功能及生活质量的影响.方法 将符合纳入标准的100例脑卒中患者随机分为干预组和对照组,两组患者均接受神经内科常规治疗和护理,在此基础上干预组给予以提高日常生活活动能力为目标的系统干预.在入组时和6周后对两组患者分别进行运动功能及生活质量测评.结果 6周后干预组患者的运动功能和生活质量明显优于对照组(P＜ 0.05).结论 日常生活活动能力的系统干预可以显著改善脑卒中患者的运动功能及生活质量.