卵巢癌细胞c－erbB2基因表达与细胞免疫的关系及基因的反义调控

利用卵巢癌细胞株３ＡＯ和ＡＯ，采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交、流式细胞分析和乳酸脱氢酶释放法，在体外进行卵巢癌细胞ｃ－ｅｒｂＢ２表达与细胞免疫的关系及ｃ－ｅｒｂＢ２反义脱氧寡核苷酸的反义调控（ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏ）研究。结果：ｃ－ｅｒｂＢ２高表达可抑制肿瘤坏死因子和淋巴因子激活杀伤细胞的杀伤活性，对以过氧化氢为代表的非特异性杀伤活性无明显影响；ｃ－ｅｒｂＢ２反义脱氧寡核苷酸可特异性降低ｃ－ｅｒｂＢ２的高表达，改善肿瘤坏死因子和淋巴因子激活杀伤细胞的杀伤活性。提示：ｃ－ｅｒｂＢ２反义脱氧寡核苷酸富含ｃ－ｅｒｂＢ２高表达，对卵巢癌的治疗有一定作用。     

大鼠容量超负荷早期心室压力变化和心肌原癌基因c-fos、c-jun、c-myc、egr-1的表达

目的:检测大鼠心脏容量超负荷(volume overload,VOL)时左心室内压变化诱导心肌原癌基因c-fos、c-jun、c-myc 、egr-1 mRNA表达的时间变化规律。方法:测定VOL 、假手术对照组大鼠术后30 min、1、4、6、12及48 h左心室收缩压(LVSP)和舒张末压(LVEDP),用狭缝杂交检测2组各时间左室心肌原癌基因表达,用密度仪进行定量分析。结果:VOL大鼠术后LVSP显著低于假手术组(P＜0.05),48 h最低;术后30 min LVEDP高于假手术组(P＜0.05),12 h最高,48 h与假手术组相近(P＞0.05);假手术组和阴性对照各原癌基因无阳性表达,AVF后1 h检测到c-fos 、c-jun、egr-1 mRNA表达,4h检测到c-myc表达,均于4h出现表达峰值,此后减弱,48h c-fos无表达,c-jun表达较弱,c-myc和egr-1仍有较高表达。结论:VOL大鼠LVEDP增加,首先诱导c-fos、c-jun、egr-1表达,c-myc表达较晚,c-myc、c-jun、 egr-1表达持续时间较长,可能反映了活体VOL刺激心肌原癌基因表达时间变化规律;当室壁受到一定程度和一定时间的负荷牵拉后心肌原癌基因即开始表达,负荷的强弱可能并非重要因素。     

小鼠牙胚cDNA文库的构建

构建具足够库容量的小鼠牙胚ｃＤＮＡ文库。方法选提取小鼠牙胚ｍＲＮＡ并反转录成ｃＤＮＡ,经ＬＤＰＣＲ扩增后,将双链ｃＤＮＡ克隆到λＴｒｉｐｌｅＸ,包手装噬本,以ＸＬ－１ｂｌｕｅ为受菌体滴定,扩增文库,用已知的牙胚基质蛋白基因引物作ＰＣＲ鉴定文库。结果：５００μｌ文库的库容量为１．３＊１０＾６ｐｆｕ,重组率为７２％,从文库中克隆到已知的５种牙胚基蛋白基因。结论构建的文库具较好的库容量和重组率及较大的插     

条件化转染MT基因小鼠模型的建立

目的建立四环素诱导调控的MT转基因小鼠模型。为血管瘤试验研究及MT致瘤机理研究奠定基础。方法通过PCR方法从鸡的基因组序列中克隆绝缘子元件；构建四环素诱导调控的条件化转基因质粒，并将其调控元件和受控元件串联成一个载体，在两元件之间插入绝缘子，以减轻两者之间的相互干扰。为提高转基因的表达效率，在转基因盒的上游亦插入绝缘子元件；将MT基因亚克隆至此载体；转基因载体功能行细胞瞬转试验及半定量逆转录-PCR验证后，将其在体外扩增、酶切、回收，行小鼠受精卵原核注射，获得转染MT基因阳性小鼠；强力霉素体外诱导部分阳性鼠MT基因表达，使其具有血管瘤表型。结果绝缘子元件成功克隆；成功构建条件化转基因载体；体外试验证实目的基因的表达受强力霉素的严格调控；通过原核注射，获得5只转基因阳性鼠；2只行体外诱导2月后。1只出现血管瘤表型，逆转录．PCR检测证实MT表达。其余3只阳性小鼠在传代建系中。结论条件化MT转基因小鼠模型成功构建，此小鼠模型能够为血管瘤的试验研究及MT致瘤机理的体内研究提供一定的基础。     

Cbfαl对釉原蛋白转录调控作用的初步分析

目的：研究Cbfαl对釉原蛋白启动子转录活性的影响。方法：利用生物信息学的方法分析釉原蛋白启动子区域的序列，确定可能存在的结合位点，将利用PCR及酶切的方法从小鼠C57BL/6J基因组上扩增的、不同长度的釉原蛋白启动子构建的虫荧光素酶报告载体与Cbfαl共转Hela细胞，分析cbfαl对不同长度的启动子转录活性的影响，将包含整个启动子区域的报告载体与Cbfαl共转Hela、CHO、UMR-106细胞，分析在不同细胞中Cbfαl对全长启动子转录活性的影响。结果：在Hela细胞中，Cbfαl对各段启动子都有激活作用，且该作用不随着启动子长度的变化而变化，在CHO、UMR-106细胞中，Cbfαl对启动子转录活性的影响很弱。结论：在Hela细胞中，Cbfαl对釉原蛋白启动子的转录活性有明显的增强作用，而且在对逐步缩短的启动子表现出一致的增强效能。结合生物信息学对Cbfαl结合位点的分析，可以初步判断在启动子下游，第一个内含子中存在Cbfαl的作用位点，另外，这种增强作用表现出明显的上皮细胞特异性，表明Cbfαl对釉原蛋白启动子的增强作用是有组织特异性的。     

GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

目的：建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠，以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除。方法：选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达，利用基因重组技术，构建GLUT4-Cre转基因表达质粒。通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核，获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定，常规方法培育、传代转基因鼠。用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果：获得5只阳性转基因首建鼠，其中3只已建系并稳定传代。在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达，而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达。结论：成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠，为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础。