小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶成熟肽编码区cDNA的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶（EMSP）成熟肽编码区的基因。方法：设计引物,以小鼠牙胚总RNA为模板,利用RT-PCR方法,扩增出小鼠EMSP的基因片段,将所得基因片段插入pBS质粒载体。转化到大肠杆菌XL-1-Blue后挑选阳性克隆,提取重组质粒DNA,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：重组质粒pBS-EMSP的酶切图谱和序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到小鼠EMSP成熟肽编码区基因。     

人牙本质基质蛋白1 cDNA序列的克隆

目的：克隆人牙本质基质蛋白１（ＤＭＰ１）成熟肽编码区基因片段。方法：用异硫氰酸胍一步法从引产胎儿牙乳头组织中抽提总ＲＮＡ,用Ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）作引物逆转录合成牙乳头ｃＤＮＡ,然后利用ＰＣＲ方法,从ｃＤＮＡ中扩增出人ＤＭＰ１成熟区的基因片段（约１．８ｋｂｐ）,将所得基因片段插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ质粒载体,转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ后挑选阳性克隆,提取重组质粒ＤＮＡ,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果：酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论：克隆到人ＤＭＰ１成熟肽编码区基因片段。     

左旋多巴和多巴胺对PC12细胞的毒性及其他抗帕金森病药物的神经保护作用

目的　研究左旋多巴和多巴胺对PC12细胞的毒性作用以及抗帕金森病 (PD)药物的神经保护作用。　方法　通过体外大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞培养 ,采用溴化 3(4 ,5 二甲基噻唑基 2 ) 2 ,5 二苯基四唑 (MTT)细胞活性检测和流式细胞仪观察不同剂量左旋多巴和多巴胺对PC12细胞的毒性作用 ,以及抗PD药物 (金刚烷胺、培高利特和司来吉兰 )能否拮抗左旋多巴和多巴胺的细胞毒性。　结果　MTT显示左旋多巴和多巴胺使PC12细胞活性降低 ,与剂量、时间相关 (P <0 0 1) ;流式细胞仪显示左旋多巴和多巴胺使PC12细胞发生凋亡 ,呈剂量依赖性 (P <0 0 1)。金刚烷胺、培高利特和司来吉兰均能保护PC12细胞活性 ,免受左旋多巴和多巴胺的影响 (P <0 0 1) ,并能抑制左旋多巴和多巴胺引起的PC12细胞凋亡 (P <0 0 5 )。　结论　大剂量左旋多巴和多巴胺对PC12细胞产生毒性损害 ,金刚烷胺、培高利特和司来吉兰能拮抗左旋多巴和多巴胺对PC12细胞的毒性效应 ,具有神经保护作用。     

长期容量超负荷心力衰竭大鼠心脏交感神经去甲肾上腺素转运蛋白表达的变化

目的：检测长期容量超负荷（VOL）条件下大鼠心肌β₁-肾上腺素能受体（β₁-AR）及其上游调控因素心脏交感神经去甲肾上腺素转运蛋白（NET）mRNA表达的变化。方法：用RT-PCR及Northern杂交检测心脏交感神经NET表达组织特异性、VOL后不同时间大鼠心脏交感神经NET及β₁-AR mRNA表达水平变化。结果：①心脏交感神经节专一性表达心脏交感神经NET基因。②VOL后3 d大鼠左心室收缩压（LVSP）下降最显著（24%）（P<0.05）此后逐渐增高,至手术后60 d高于对照组32.8%（P<0.05）;3-30 d舒张末压（LVEDP）显著增177.96%-234.75%（P<0.05）,术后60 d恢复至对照组水平（P>0.05）。③与对照组比较VOL大鼠术后3-30 d NET、β₁-AR mRNA表达无下降（P>0.05）,60 d NET RT-PCR及Northern杂交检测分别显示下降43.3%（P<0.05）和 63.5%（P<0.05）,Northern杂交显示β₁-AR下降50%（P<0.05）。结论：长期心脏VOL大鼠左心室β₁-AR mRNA可维持较长时间稳定与心脏交感神经NET mRNA表达相对稳定有关。NET表达正常对维持β₁-AR对肾上腺素能刺激的敏感性,维持心脏收缩功能正常可能有重要意义。     

人牙胚cDNA文库的构建

目的构建具足够库容量的人牙胚cDNA文库.方法提取人牙胚mRNA并反转录成cDNA,经LDPCR扩增后,将双链cDNA克隆到λTripleX2中,包装噬菌体,以XL-1-Blue为受体菌滴定、扩增文库,用两端引物做PCR鉴定.结果500μl文库的库容量为0.8×106pfu,重组率为83%,10个克隆有9个可扩增出cDNA片段,长度为500～2000bp.结论构建的文库具较好的库容量、重组率以及较大的插入片段.     

AML1-ETO转基因小鼠的建立及初步表型分析

目的:建立AM L1-ETO融合基因转基因小鼠,在整体动物水平研究AM L1-ETO融合蛋白在白血病发病中所起的作用。方法:构建hCG/AM L1-ETO转基因质粒,通过显微注射将该质粒转入小鼠受精卵中,植入假孕母鼠输卵管,获得G0代转基因小鼠;用聚合酶链反应(PCR)方法检测融合基因的整合情况,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测融合基因的表达情况和组织表达谱。结果:PCR法共检出10只G0代转基因阳性小鼠,其中8个系均产下F1代小鼠,由此建立了8个AM L1-ETO转基因小鼠系。RT-PCR法证实AM L1-ETO融合基因在22系中稳定表达,但血常规、肝脏、脾脏等组织未见异常变化;对该系小鼠的组织表达谱检测表明,融合基因在肝脏、脾脏、心脏和肌肉组织存在不同程度的表达,但在脑组织中不表达。结论:AM L1-ETO融合基因能在转基因小鼠的骨髓等组织中表达,但尚不足以引发白血病,推测其他致病基因在小鼠白血病的发生中也起一定作用。     

胃动素受体多克隆抗体的制备及其受体在人胃的表达

目的制备胃动素受体多克隆抗体和研究该受体在人胃中的组织定位。方法通过合成肽耦联钥孔戚血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)制备抗体,以ELISA方法测定效价。用含有GPR38基因(胃动素受体)的质粒转染293细胞株,以RT-PCR方法鉴定。Westernblot和免疫组织化学法检测转染的293细胞和组织中胃动素受体的表达。结果制备的兔抗人的多抗效价达1∶500000,有较好的特异性。成功转染293细胞,该细胞能够瞬时表达胃动素受体,而该受体在人胃窦胃体的黏膜腺上皮中表达。结论应用合成肽-KLH成功地制备了胃动素受体的兔抗人多克隆抗体,用该抗体检测到人胃窦胃体黏膜上皮细胞存在胃动素受体的表达。     

红霉素促动力作用易感性的实验研究

自从红霉素被发现能够诱发类似胃动素诱发狗的胃收缩以来,其促动力的作用就引起了许多学者的广泛兴趣.有研究发现,红霉素及其衍生物(又称胃动内酯)可能是作为一种胃动素的激动剂而促进动物和人胃肠的运动.     

牙齿修复相关转基因研究：显微注射法获得pTet-on-CX转基因工具小鼠G0代的实验观察

目的：为便于进行规模化的转基因研究，构建一种四环素调控性转基因体系中的工具小鼠系。方法：实验于2002—06／10在上海南方模式生物研究中心完成。以cβ—actin启动子取代pTet—on—NSE质粒中的NSE启动子，构建转基因载体pTet-on-CX；将XhoⅠ酶切线性化的载体DNA注射到小鼠受精卵的雄原核，移植到假孕母鼠的输卵管。仔鼠出生后，经PCR及Southern Blotting检测阳性小鼠。结果：注射的受精卵共存活603枚，移卵后产仔64只，阳性6只。阳性鼠分别传代开始建系。结论：通过显微注射的方法获得pTet—on—CX转基因工具小鼠的G0代，为规模化的转基因研究(包括与牙齿修复有关的基因，如牙本质涎磷蛋白基因)奠定了基础。