腺病毒-甲病毒杂合载体的构建

目的将腺病毒Ad5/F11p造血细胞靶向和甲病毒复制子载体目的基因高效转录的特点相结合,构建腺病毒-甲病毒杂合载体,以提高目的基因在造血细胞的表达水平。方法基本实验过程包括骨架质粒构建,穿梭质粒构建,同源重组产生杂合病毒基因组,杂合病毒在包装细胞的拯救和扩增,以及杂合病毒对造血细胞基因转移效率的初步评价。具体步骤如下：利用重叠延伸PCR技术将pFiber5/11p质粒上Ad5的E4区部分删除产生骨架质粒pAdEasy/F11pDE4orf3。在pShuttle质粒的多克隆位点处分别插入造血细胞特异性启动子（CD11a promoter,CD11Ap）、甲病毒载体元件（nsP）、目的基因（GFP）、PolyA加尾信号构建杂合穿梭质粒pSh-SFV-GFP。骨架质粒与穿梭质粒在大肠杆菌BJ5183菌株中同源重组产生杂合病毒质粒pAd5/F11p-SFV-GFP,经与辅助病毒质粒Ad5/f11p-HV共转染293细胞后拯救出杂合病毒Ad5/F11p-SFV-GFP,经CsCl密度梯度离心法纯化,得到的病毒滴度为3×1010pfu/ml。与对照病毒Ad5-GFP相同感染复数（100MOI）分别感染U937细胞,利用流式细胞术检测GFP＋细胞比例。结果pAdEasy-1/F11p-E4orf3和pSh-SFV-GFP经相应酶切和测序鉴定,与预期设计一致;CsCl密度梯度离心纯化得到杂合病毒;100MOI Ad5/F11p-SFV-GFP感染U937细胞2 d后,GFP＋细胞比例为55.79%,而对照病毒Ad5-GFP的感染效率为2.42%。结论成功构建了腺病毒-甲病毒杂合载体,为进一步评价其对造血细胞的基因转移效率奠定了基础。     

凝血酶促进骨髓间充质干细胞增殖的作用与机制

本研究旨在探讨凝血酶促进人间充质干细胞（MSC）增殖及其机制。在无血清基础培养液中添加不同浓度凝血酶,用MTT实验检测人骨髓MSC增殖状态,PCR检测细胞蛋白酶活化受体（PAR）和c-MYC表达,Westernblot分析信号通路的变化,并通过特异性抑制剂阻断凝血酶受体和信号通路,验证凝血酶作用的机制。结果显示,凝血酶可显著刺激MSC增殖,效应呈浓度依赖性;当凝血酶浓度为0．5U／ml时,细胞增殖明显提高,浓度为8U／m1时,刺激活性达峰值（P〈0．01）;PCR结果表明,MSC表达PAR-1和PAR2;当PAR1受体被阻断后凝血酶的促增殖效应被抑制,而PAR2受体被阻断后凝血酶对增殖结果影响不明显;凝血酶刺激MSC后,信号分子AKT发生磷酸化,c-MYC基因表达上调;当AKT信号通路被抑制后,c-MYC表达被抑制,凝血酶刺激细胞增殖效应被明显抑制。结论：凝血酶可通过PAR1受体介导的AKT信号通路的活化,上调MYC基因的表达,从而促进间充质干细胞的增殖。     

Ad(E1-).sT治疗乳腺癌移植瘤的作用及体内免疫激活效应

目的研究复制缺陷型腺病毒Ad(E1-).s T治疗小鼠乳腺癌移植瘤的作用,探讨Ad(E1-).sT的免疫激活效应。方法指数生长期的小鼠乳腺癌细胞4T1按2×10~6细胞/100μl PBS皮下荷瘤4～6周龄的BALB/c小鼠,建立具有完全免疫系统的乳腺癌移植瘤模型。荷瘤后第7天,将成瘤小鼠分为Buffer治疗组、Ad(E1-).Null治疗组和Ad(E1-).s T治疗组,分别瘤内给予PBS、Ad(E1-).Null和Ad(E1-).s T(2.5×10~(10) VPs/小鼠)进行治疗;第10天,重复治疗一次。于第7、12、15、19天,分别测定肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线,于第12、18天,内眦静脉取血,检测小鼠血象和外周血T淋巴细胞亚型;于第19天处死小鼠,剥离肿瘤,测定肿瘤重量,并分离脾脏细胞,测定树突状细胞(DCs)的比例和数量。结果 Ad(E1-).s T治疗能够有效抑制乳腺癌移植瘤的生长,抑制肿瘤重量的增加。在机制上,Ad(E1-).s T能够调节小鼠外周血的血象,抑制淋巴细胞、粒细胞和中间细胞的增长;同时,Ad(E1-).s T能够促进T淋巴细胞的成熟和分化,降低未成熟淋巴细胞的比例,促进CD4~+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的增殖。此外,Ad(E1-).s T还增强小鼠脾脏DCs的扩增与成熟。结论 Ad(E1-).s T可通过调节机体抗肿瘤免疫反应,抑制乳腺癌移植瘤的生长。     

前列腺癌特异性启动子P（A）PTp的构建及评价

目的构建前列腺癌特异性启动子PSAe（AREc）-PSMAe-TARPp[P（A）PTp],并在腺病毒水平评价其启动目的基因表达的效率和特异性。方法巢式PCR扩增基因组DNA获得PSAe的AREc区基因、PSMAe基因和TARPp基因,并依次连接获得嵌合启动子P（A）PTp。采用Adeasy系统构建并制备P（A）PTp启动增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）表达的重组腺病毒Ad-pSh-P（A）PTp-EGFP。不同感染复数（multi-plicity of infection,MOI）的Ad-pSh-CMV-EGFP感染各细胞系后48 h,流式细胞术确定最佳MOI;并以最佳MOI的Ad-pSh-P（A）PTp-EGFP感染各细胞系,检测EGFP的表达效率。结果 PCR成功扩增并连接获得嵌合启动子基因P（A）PTp。采用Adeasy系统,构建并制备了重组腺病毒Ad-pSh-P（A）PTp-EGFP。Ad-pSh-CMV-EGFP感染后,流式检测结果显示,前列腺癌细胞PC3和PC3M细胞的最佳MOI为100 MOI;而前列腺癌细胞DU145以及肝癌细胞SMMC-7721和HepG2为250 MOI。最佳MOI的Ad-pSh-P（A）PTp-EGFP感染后,EGFP在各细胞系中的表达效率[P（A）PTvsCMV]为：PC3（25.56%vs77.76%）、DU145（50.50%vs65.26%）、PC3M（30.81%vs89.70%）、HepG2（6.26%vs63.76%）、7721（2.27%vs67.84%）。结论成功构建前列腺癌特异性嵌合启动子P（A）PTp,并证实能在前列腺癌细胞中特异并有效地启动EGFP的表达。     

Adhesion induces matrix metalloproteinase-9 gene expression in ovarian cancer cells

The processes of cell invasion includes adhesion, proteolysis of extracellular matrix (ECM) and migration. It is not only related to cancer cells metastasis, but also involved in infiltration of immune effector cells,embryogenesis and angiogenesis. During the invasioncells attach and spread on the ECM, secrete proteinase to hydrolyze ECM, and then move through interstitial stroma. Matrix metalloproteinases (MMP), especially MMP-2 and MMP-9, play an important role in this processe[1,2].…     

土壤放线菌3423代谢产物的分离纯化及结构鉴定

目的 对土壤来源的Streptomycessp．3423代谢产物中的抗肿瘤活性成分进行分离纯化和结构鉴定。方法 采用MTT法，以对K562细胞的抑制活性为指标，筛选活性菌株。发酵培养液经各种色谱技术分离纯化，并通过对其理化性质、质谱、紫外、红外和核磁共振等图谱数据分析，确定化合物的结构。结果和结论 Streptomycessp．3423代谢产物中分离得到6个哌嗪二酮类化合物。生物学活性研究发现化合物Ⅲ和Ⅳ对K562细胞具有抑制活性，其中化合物Ⅳ活性最强，IC50为14．1μg／ml。     

RKIP介导的ERK通路在电磁辐射致海马神经元损伤中的作用

目的:研究电磁辐射对原代培养海马神经元Raf激酶抑制蛋白(RKIP)和磷酸化ERK表达的影响,应用MEK的抑制剂U0126探讨RKIP介导的ERK通路在辐射损伤中的作用.方法:体外培养原代海马神经元,采用X-HPM、S-HPM及EMP作为辐射源,分别建立3种电磁辐射细胞模型.通过免疫荧光标记、激光扫描共聚焦显微镜检测RKIP和磷酸化ERK的表达;利用Annexin V-PI双标记、流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡与坏死率.结果:三种电磁辐射后海马神经元RKIP表达均减少,磷酸化ERK表达均增加,且胞核移位发生,辐射组间均未见明显差异;U0126预处理组较单纯辐射组神经元的凋亡与坏死率明显降低,但仍高于假辐射组.结论:RKIP介导的ERK通路过度激活是电磁辐射致海马神经元凋亡与坏死的重要机制之一,U0126对电磁辐射损伤具有一定防护作用.     

CO_2激光治疗牙龈瘤及牙龈增生106例体会

ＣＯ_２激光治疗牙龈瘤及牙龈增生１０６例体会自１９９０年３月～１９９３年６月,我们采用ＣＯ２激光治疗牙龈瘤及牙龈增生患者１０６例,取得满意疗效,现报告如下：１０６例患者中,男４９例,女５７例;年龄８岁至７５岁,其中牙龈瘤８１例,牙龈增生２５例。ＣＯ２?..     

纤维细胞和Th1/Th2型细胞因子在放射性肺损伤中的作用及相关机制

目的 观察小鼠经60Co γ射线胸部照射后肺组织中纤维细胞和Th1/Th2型细胞因子变化规律,探究其在放射性肺损伤中的作用及相关机制.方法 小鼠经60Coγ射线单次胸部照射25 Gy,建立肺损伤模型,用HE染色和Masson三联染色观察肺组织病理变化,酶标仪测定Ⅰ型胶原浓度,流式细胞仪测定小鼠肺实质中纤维细胞数目,液相悬浮芯片检测肺泡灌洗液中纤维化相关细胞因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞炎症/性蛋白-1α(MIP-1α)和Th1/Th2型细胞因子表达.结果 照后14 d至3个月,小鼠体重明显下降(F=7.19、40.62、58.70,P＜0.05).1个月时小鼠肺组织胶原纤维增生,第3个月时更加明显.照后1～3个月,Ⅰ型胶原浓度明显增加(Z=-2.470、-2.236,P＜0.05).照射后14 d至3个月,纤维细胞数目增多(Z=-2.19、-2.64、-2.64,P＜0.05),肺灌洗液中MCP-1(Z=-2.35、-2.37、-2.34,P＜0.05)及MIP-1α(Z=-2.43、-2.35、-2.35,P＜0.05)表达增高.Th1型细胞因子IFN-γ在照后1个月短暂升高(Z=-2.34,P＜0.05),IL-12在照后3d及7d下降(Z=-2.31、-2.30,P＜0.05),1个月及3个月升高(Z=-2.32、-2.12,P＜0.05);Th2型细胞因子IL-4在照后7、14 d及1个月表达升高(Z=-2.31、-2.35、-2.32,P＜0.05),IL-10在照后3d及1、3个月升高(Z=-2.33、-2.37、-2.34,P＜0.05).结论 纤维细胞是诱发放射性肺损伤的重要效应细胞,MCP-1及MIP-1α能明显诱导纤维细胞聚集,Th1/Th2可能参与调节这一过程.