创伤合并γ射线照射后大鼠脾脏Treg/Th17平衡的变化及其意义

目的 观察创伤大鼠经SGy γ射线全身照射后伤口愈合情况及脾脏Treg/Th17平衡变化的特点,探讨两者之间的关系及意义.方法 清洁级雌性Wistar大鼠65只,按体重随机分为正常对照组(正常组)、单纯创伤组(单伤组)和创伤+5Gy γ射线全身照射组(伤照组).分别于伤照后1、3、7、14、21、28d,检测各组大鼠伤口残留面积及外周血白细胞和淋巴细胞计数,并采用流式细胞仪测定脾脏Treg细胞和Th17细胞亚群的变化.结果 伤照后7～21d伤照组伤口残留面积持续大于单伤组(P＜0.01),21d时单伤组伤口已基本愈合,而伤照组延迟至28d才基本愈合.单伤组伤照后1～ 7d外周血白细胞及淋巴细胞计数均明显低于正常组(P＜0.05,P＜0.01).伤照组1～14d时外周血白细胞及淋巴细胞计数均显著低于正常组和单伤组,21～28d时白细胞计数仍显著低于正常组和单伤组(P＜0.05,P＜0.01).伤照组大鼠脾脏Treg细胞仅在伤照后3d和7d高于正常组和单伤组(P＜0.01),而Th17细胞于伤照后1d即显著增高(P＜0.01),3d时升至最高,至28d时才恢复至正常组和单伤组水平.伤照组1～21d时Treg/Th17比值均显著低于正常组和单伤组(P＜0.01),至28d时恢复至正常组和单伤组水平.结论 5Gy γ射线全身照射可导致大鼠创伤愈合延迟,Treg/Th17平衡失调在其中可能发挥了重要作用.     

γ射线照射后小鼠CD4+CD25+调节性T细胞的变化及其意义

目的 观察γ射线照射对小鼠CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)亚群的影响,探讨辐射诱发的免疫损伤作用机制.方法 C57BL/6小鼠经6 Gy γ射线照射后1～28 d取胸腺、脾脏称重并计算脏器系数,测量外周血WBC总数,流式细胞仪检测外周血和脾脏CD4+T细胞、Tregs细胞亚群的变化.结果 照射后1 d,胸腺和脾脏系数即明显下降,7 d降至最低,至照后28 d仍未恢复到对照组水平.WBC于照后1～7 d持续降至最低,14 d开始恢复,至28 d仍显著低于对照组.外周血CD4+T细胞在照后1 d-过性降低后逐渐增高,照后28 d基本接近对照水平;脾脏CD4+T细胞在照后7 d虽略有降低,但在14和28 d基本维持在对照水平.外周血Tregs细胞在照后1 d即开始升高,7 d达峰值,14和28 d仍明显高于对照组;脾脏Tregs于照后1 d即显著增至最高,而后缓慢降低,至照后28 d出现有统计学意义的降低(t=2.731,P＜0.05).结论 小鼠经6 Gy γ射线全身照射后胸腺和脾脏免疫组织严重受损,免疫细胞数量减少;而具有免疫抑制作用的Tregs细胞比例照后明显增高,揭示该亚群与辐射所致的小鼠免疫功能受抑和免疫调节失衡密切相关.

Abstract：

Objective To observe the effect of γ-ray irradiation on CD4 + CD25 + regulatory T cells (Tregs),and to investigate the mechanism of immune injury induced by irradiation.Methods The thymus and spleen of C57BL/6 mice were taken and weighted 1-28 d after γ-ray irradiation,and the organ coefficients were calculated.The amount of mouse peripheral WBC measured,CD4 + T cells and Tregs in peripheral and splenic were analyzed by flow cytometry.Results Coefficients of mouse thymus and spleen decreased significantly 1 d post irradiation,and reached to the bottom at 7 d.Coefficients did not recover to control level 28 d after radiation.Peripheral WBC continuously decreased and reached the bottom at 7 d,and did not recover to control level up to 28 d postirradiation.Peripheral CD4 + T lymphocyte temporally reduced at 1 d,while it increased at 7 d,and it approached to control level at 28 d after radiation.Splenic CD4 + T cells slightly reduced at 7 d however,they basically maintained as the same level as control 14 d and 28 d after radiation.Peripheral Tregs ascended at 1 d and reached the peak at 7 d,and reduced at 14 d and 28 d postirradiation,although they still were significantly higher than those of control group.At the same time,splenic Tregs increased significantly and achieved peak value at 1 d,and then gradually decreased and reached the minimum at 28 d after irradiation,which were significantly lower than those of control group( t =2.731,P ＜ 0.05).Conclusions Mouse thymus and spleen were injured severely,and the number of immunocytes decreased after 6 Gy whole body γ-ray irradiation.However,Tregs with immunosuppressive action increased significantly postirradiation,revealing that Tregs were closely correlated with immune function depression and immunomodulation imbalance induced by ionizing radiation.     

IL-21通过 SENP1调控 NK细胞生物学特性

目的 探讨IL-21对小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1(SENP1)表达的影响及其对NK细胞生物学特性的调控作用.方法 以NK92细胞系为模型,采用慢病毒介导的Senp1基因干涉策略,抑制NK92细胞SENP1的表达.实时荧光定量PCR和Western印迹检测SENP1表达水平;利用CCK-8细胞增殖检测试剂盒测定细胞增殖活性;Annexin Ⅴ-APC/PI标记检测细胞凋亡.将K562细胞与NK92细胞共培养,荧光素酶报告基因方法检测NK92细胞的杀伤活性.结果 IL-21处理上调NK92细胞SENP1的表达;慢病毒介导Senp1-shRNA转染显著降低NK92细胞内Senp1 mRNA和蛋白表达水平.Senp1干涉组NK92细胞增殖能力较对照组明显降低.同时,干涉Senp1能促进NK92细胞凋亡,但对NK92细胞杀伤K562活性无显著影响.结论 IL-21上调NK92细胞SENP1的表达;干涉Senp1能抑制NK92细胞增殖,促进细胞凋亡,同时影响穿孔素表达和对肿瘤细胞的杀伤活性.     

Ad－HGF基因修饰的胎盘间充质干细胞治疗兔肢体缺血的实验研究

目的：研究重组腺病毒介导肝细胞生长因子（ adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor,Ad－HGF）修饰的胎盘源间充质干细胞（ placenta－derived mesenchymal stem cells,PMSC）在兔肢体缺血模型中促新生血管生成的作用。方法无菌取足月产妇胎盘胎儿面中心区域胎盘组织,胶原酶消化法分离干细胞,体外培养传代,感染Ad－HGF 48 h后收集细胞用于治疗兔肢体缺血实验。左侧治疗组后肢缺血肌肉组织内多点注射总细胞数5×106／ml Ad－HGF修饰的PMSC,右侧对照组后肢缺血肌肉组织内注射生理盐水。结果治疗后第14天腹主动脉穿刺行数字减影血管造影（ digital subtraction angiography,DSA）检查,可见左侧肢体缺血治疗后微血管生成数明显多于未治疗右侧肢体,血管形成能力明显增强。苏木精伊红染色法（ HE）后置光镜下观察显示,治疗组毛细血管密度明显大于未治疗组（P＜0．05）。实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction,qPCR）检测后肢肌肉组织中血管内皮生长因子（ vascular endothelial growth factor, VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（ basic fibroblast growth factor,bFGF）、HGF的表达明显升高（P＜0．05）。结论经Ad－HGF基因修饰的PMSC能明显促进血管新生,加快局部缺血组织血流循环的重建,是治疗肢体慢性缺血的有效手段。     

TRAIL胞外段基因克隆及其表达与纯化

目的克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因(the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex),构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段.方法抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞,用RT-PCR、巢式-PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA,并克隆到pGEM-T Easy载体中,DNA测序鉴定.将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T,构建重组表达质粒pGEX/TRAILex,用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段,GST-Agarose 4B层析柱纯化GST-TRAILex融合蛋白,Westem-blot鉴定纯化产物.结果抗CD3 McAb能诱导正常人外周血单个核细胞TRAIL的高表达,成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因,构建了重组表达载体pGEX/TRAILex,IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段,经12%SDS-PAGE分析,可观察到一分子量和理论值相符(约54kD)的诱导表达带.Kodak软件分析表面GST-TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28%,进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达,用GST-Agarose4B层析柱纯化超声破菌后的上清,每升细菌培养液可得到9.8 mg纯度的95%以上的GST-Tex.Western-blot结果证实54KD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应.结论成功地克隆了人TRAIL基因,并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段,为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础.     

小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1对脐静脉内皮细胞增殖、迁移和凋亡的影响

目的探讨小泛素相关修饰蛋白特异性蛋白酶1(SENP1)对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移及凋亡的影响。方法用20个感染复数的p LKO.1-SENP1-小发夹RNA(shRNA)-绿色荧光蛋白(GFP)干涉慢病毒(SENP1干涉组)和p PIG-U6-随机序列(scramble)-GFP对照慢病毒(GFP-SC对照组)感染HUVEC。病毒感染HUVEC 48 h后,用流式细胞仪检测慢病毒的感染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western蛋白质印迹法检测HUVEC内SENP1基因和蛋白表达水平。用CCK8试剂盒检测细胞增殖能力,Transwell小室法检测细胞的迁移能力,流式细胞仪分析细胞凋亡率。结果 GFP-SC对照组和SENP1干涉组感染效率均>97%。与GFP-SC对照组比较,SENP1干涉组HUVEC SENP1基因和蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。CCK8法测定结果表明,SENP1干涉组HUVEC增殖能力较GFP-SC对照组明显降低(P<0.01)。SENP1干涉组细胞迁移过Transwell小室的细胞数量明显低于GFP-SC对照组(P<0.01)。用低浓度血清(含2%胎牛血清)培养基诱导细胞凋亡24 h,SENP1干涉组细胞凋亡率即已升高到GFP-SC对照组的2倍左右(P<0.05);诱导凋亡至48 h,SENP1干涉组细胞凋亡率升高到对照组的3.2倍左右(P<0.05)。结论 HUVEC内SENP1表达水平的降低不仅可以显著抑制细胞增殖和迁移能力,亦可促进细胞凋亡。     

TGF-β3在小鼠放射性肺纤维化中的作用研究

目的观察经60 Coγ射线全胸照射后小鼠肺脏的改变,探究转化生长因子-β3(TGF-β3)在小鼠放射性肺纤维化中的作用。方法180只C57BL/6雌性小鼠随机分为对照组、照射组和TGF-β3组。照射组和TGF-β3组经60 Co γ射线单次全胸照射,照射后每周分别腹腔注射0.5 ml 0.9%生理盐水和TGF-β3(1μg/kg)一次。于照射后3、7、14 d和1、3、6个月活杀,肺脏经HE和天狼星红染色观察病理,检测小鼠肺内循环纤维细胞( CF)的数量。结果建立小鼠放射性肺纤维化模型。照射后6个月时,TGF-β3组肺脏见点状实变,部分成纤维细胞增生,少量胶原纤维沉积。照射后14 d到6个月,照射组肺脏 CF 数量比对照组明显增加( P <0.05)。照射后1个月时,TGF-β3组肺脏CF数量比照射组明显减少( P<0.05)。结论 TGF-β3使CF在肺内的聚集明显减少,其可能在延缓肺纤维化发生过程中发挥重要作用。     

Beclinl基因沉默对胰腺癌MiaPaCa-2细胞生长的影响

Beclin1基因与酵母自噬基因Atg 6同源,是参与哺乳动物自噬体形成,调控细胞自噬过程的重要基因.Beclin1自噬基因的缺陷可能导致肿瘤细胞逃避自噬性死亡[1],而稳定转染Beclin1后可促进细胞的自噬活性,并降低了其成瘤能力[2].本研究观察沉默胰腺癌MiaPaCa-2细胞的Beclin1基因表达后对其增殖、凋亡及细胞周期分布的影响,为胰腺癌的基因治疗提供新的思路. 一、材料与方法 1.靶向Beclin1的siRNA表达载体构建：根据siRNA设计原理,由上海吉玛制药技术有限公司构建3个插入靶向Beclin1基因的siRNA（Beclin1-siRNA）质粒以及阴性对照siRNA（NC-siRNA）质粒和荧光标记的siRNA（FAM-siRNA）质粒.经筛选后选择沉默效果最好的Beclin1-siRNA序列插入表达载体U6/Neo,构建表达载体U6/Neo-shBeclin1,同时构建阴性对照载体pGPU6/Neo-shNC及荧光对照载体pGPU6/GFP/Neo-shNC.     

重离子辐射对人外周血T淋巴细胞生物学性能的影响

目的研究重离子对人外周血T淋巴细胞增殖、凋亡等生物学性能的影响并探讨其机制,为肿瘤放射治疗的辐射防护提供实验依据和基础。方法 Ficoll分离法分离人外周血T淋巴细胞,采用12C重离子束坪区照射,照射样品能量为70 MeV、LET=29 keV/μm,照射剂量为1.0和2.0 Gy,剂量率为0.5 Gy/min。分别于照射后12、24h,RT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2,Bax,Caspase3,Caspase8和Caspase9的表达;于照射后24、48 h,CCK8法检测细胞增殖能力;于照射后24、48 h,采用AnnexinV-PE/7-AAD、AnnexinV-FITC/PI法检测凋亡发生,并采用RT-PCR检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Caspase3的表达。结果重离子照射可明显抑制人外周血T淋巴细胞的增殖,随着剂量增大,抑制作用更加明显。同时,重离子照射可促进T淋巴细胞的凋亡,特别是对于晚期凋亡的诱导作用（P〈0.01）。RT-PCR检测结果显示,重离子辐射可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表达（P〈0.01）。结论重离子辐射可显著影响抑制T淋巴细胞的增殖并促进其凋亡。