人血管内皮生长因子受体2胞外段在毕赤氏巴斯德酵母中的表达

目的探讨在毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）中高效表达有真核蛋白结构的人血管内皮生长因子受体2胞外段（heVEGFR-2）的可行性。方法从重组质粒pORF-heVEGFR-2经PCR获全长heVEGFR-2 DNA,构建重组毕赤氏巴斯德酵母分泌性表达载体,电转化Pichia pastoris X-33。用抗药性表型和甲醇诱导筛选出重组heVEGFR-2蛋白表达阳性的转化子（X-33-heVEGFR-2）。结果SDS-PAGE显示,获分子量约108kDa的重组heVEGFR-2蛋白,约占X-33-heVEGFR-2分泌性表达蛋白总量的45％。该重组蛋白在表达上清中的质量浓度达80mg／L。其heVEGFR-2部分分子量约106kDa。Western blot证实,该蛋白能特异地与大鼠抗小鼠VEGFR-2单克隆抗体结合。结论毕赤氏巴斯德酵母能高效表达有真核蛋白结构的人血管内皮生长因子受体2胞外段蛋白全段。     

阳离子脂质体-DNA复合物与脂质-鱼精蛋白-DNA复合物体外细胞转染率比较

采用薄膜-挤压法制备空白阳离子脂质体后,再分别制得阳离子脂质体-DNA复合物和脂质-聚阳离子-DNA复合物(Lipid-polycation-DNA lipopolyplexes,LPD);用凝胶阻滞实验,确定阳离子脂质体与质粒DNA的配比;用透射电镜观察阳离子脂质体-DNA复合物和LPD的形态,用激光粒度仪测定它们的粒径和zeta电位;用酶标仪测定它们对张氏(Chang)肝细胞、HepG2肝癌细胞的转染率。结果表明阳离子脂质体-DNA复合物和LPD的形态均近似于球体,但LPD的粒径明显较小;LPD对张氏(Chang)肝细胞和HepG2肝癌细胞的转染率均高于阳离子脂质体-DNA复合物。LPD是基因治疗的临床应用中一种更具前景的载体系统。     

人热休克蛋白90β-cDNA基因克隆及其真核表达载体的构建

本研究旨在克隆人热休克蛋白90β（HsP90β）基因，构建其真核表达载体pcDNA3．1（＋）-hHSP90β，为研究hHSP90β的基因治疗奠定实验基础。按Invitrogen公司操作说明用TRIzolReagent提取鼻咽癌总RNA，并经RT—PCR获得hHSP90βcDNA。用纯化的hHSP90βcDNA与PGEMEasy T Vector连接，挑选白色菌落进行鉴定，结果为重组质粒，命名为PGEM—hHSP90β。将PGEM—hHSP90β及pcDNA3．1（＋）质粒经AfllI和Xbal双酶切、胶回收纯化酶切片段后，体外连接酶切片段，使其定向重组，再将重组DNA转化XL1-blue，经复苏后。在含Ampr的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。挑取的LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定，证实为阳性克隆，即hHSP90β与pcDNA3．1（十）体外重组成功，命名为pcDNA3．1（＋）-hHSP90β。采用体外重组技术，成功地将人HSP90β插入了真核表达载体pcDNA3．1（＋）中。     

小鼠CD40L重组腺病毒载体的构建

目的构建含有小鼠CD40L基因的重组腺病毒载体,为研究mCD40L的生物学特性及肿瘤基因治疗提供基础。方法用XhoI、SwaI双酶切质粒pORF-mCD40L,回收1955bp基因片断并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中XhoI、EcoRV双酶切位点,得到重组质粒pSh-mCD40L。经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞。14天左右观察细胞病变及PCR鉴定重组的腺病毒。结果酶切分析、PCR验证mCD40L基因克隆到腺病毒pAdEasy-1载体中。结论成功构建表达mCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能和基因治疗提供了基础。     

大鼠睾丸限制性表达新基因Rtap2a的生物信息学分析

目的为进一步研究我们克隆到的大鼠新基因Rtap2a,本研究采用多种生物信息学方法对该序列进行特征分析和功能预测,以获得该基因及其编码蛋白更多的功能提示。方法应用B1ast、ORFFinder、ScanProsite、TMpredServer和UniGene等软件或数据库,进行序列的相似性比较,开放读码框预测、染色体定位、电子表达谱和编码蛋白质的功能等分析。结果我们得到的Rtap2a序列是该基因的全长cDNA序列,在多物种间高度保守,该基因编码的蛋白可能为一N端在胞内的单次跨膜蛋白;其小鼠同源基因的电子表达谱提示Rtap2a特异地高表达于睾丸组织,在成年小鼠的睾丸中表达量最高。结论大鼠新基因Rtap2a是一睾丸限制性表达的新基因,其编码蛋白单次跨膜,进化上高度保守,可能在哺乳动物的睾丸发育和精子发生过程中具有重要功能,也有可能参与肿瘤的发生、发展等过程。因此,新基因Rtap2a有进一步研究的价值。     

鸡Tie-2受体胞外片段的原核表达及目的蛋白免疫原性的研究

目的研究鸡Tie-2受体胞外片段(配体结合域)的原核表达以及目的蛋白对小鼠的抗原性。方法用PCR方法从既往构建的包含鸡Tie-2受体胞外段基因的表达质粒扩增目的片段,进而构建PQE原核表达载体并诱导其目的蛋白的表达,将目的蛋白进一步纯化、复性并免疫小鼠,获得抗血清,用ELISA和Western blotting检测抗血清中抗体的存在。结果经酶切分析及测序鉴定表明获得了鸡Tie-2受体胞外目的片段的PQE原核表达载体,能高效表达目的蛋白,将其免疫小鼠可产生抗重组蛋白的抗体。结论用原核表达的方式可成功的获得鸡Tie-2受体胞外目的片段的蛋白,并对小鼠产生免疫原性。     

氧化型甘露聚糖修饰的LL/2c肿瘤细胞疫苗诱导Th1免疫反应

目的：观察氧化型甘露聚糖修饰的LL／2c肿瘤细胞疫苗(Oxidative mannan-conugated LL/2c,ox-ML)能否诱导Th1抗瘤免疫反应。方法：乙醇固定的LL/2c细胞(fixed LL／2c,f—L)、ox—M—L腹腔免疫小鼠,取脾脏制备T淋巴细胞悬液,采用ELISA检测体外刺激的T细胞INF-γ、IL-4分泌,^51Cr释放实验观察CTL。(cytotoxic T lymphocytes,CTL)杀伤活性。结果：ox—M—L免疫小鼠的T细胞经丝裂霉素C预处理的LL／2c体外刺激,其INF-γ分泌显著提高：^51Cr释放实验显示出对LL／2c细胞特异性的CTL杀伤活性,且这种杀伤活性具有CD8 T细胞的依赖性：未修饰的LL／2c免疫小鼠的T细胞诱导了较高的IL-4分泌,但未显示出CTL杀伤活性。结论：LL／2c肿瘤细胞作为抗原,经氧化型甘露聚糖修饰有效的诱导了Th1类型的抗瘤免疫反应。     

针对表皮生长因子受体基因RNA干扰质粒表达载体的构建

目的:表皮生长因子受体(EGFR)是一种酪氨酸激酶跨膜受体,人类的多种恶性肿瘤的发生与表皮生长因子受体过度表达有关。EGFR已成为阳性表达肿瘤的重要治疗靶标。在哺乳动物细胞中,RNA干扰是通过与目的基因特异互补的21-23个硷基的小双链RNA来抑制该基因的表达。有研究表明表达小发夹RNA的载体能诱导产生更好的RNA干扰效果。本实验通过向pSIREN-Shuttle质粒插入一段可被转录成小发夹RNA的双链寡核苷酸序列(其中含有于EGFR基因序列相同的19nt序列)重构了RNAi质粒表达载体。通过细胞转染评价该载体对人鼻咽癌细胞株(HNE1)EGFR基因的mRNA表达抑制效果。结果显示HNE1细胞的EGFR基因mRNA被明显抑制。提示shRNA质粒表达载体介导对EGFR基因的RNA干扰可能是鼻咽癌干预治疗的一种有效手段。     

DPC4重组质粒的构建及其对人胰腺癌细胞的抑制作用

目的：构建DPC4基因重组质粒以研究DPC4对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法：应用PR-PCR技术扩增出野生型DPC4基因全长cDNA，然后用分子克隆技术构建其真核表达载体，应用脂质体法将DPC4基因导入到人胰腺癌PC-3细胞中，经G418筛选获得可稳定表达DPC4的人胰腺癌细胞，观察DPC4基因对人胰腺癌细胞周期和细胞增殖的影响。结果：获得了野生型DPC4真核表达质粒pcDNA3.1-DPC4，野生型DPC4的导入可引起胰腺癌G1期细胞的增加和S期细胞相应减少，同时抑制细胞生长。结论：野生型DPC4基因具有调节胰腺癌细胞增殖的功能，可作为胰腺癌基因治疗的靶基因。     

小鼠血管内皮生长因子受体2胞外片段重组蛋白的制备及其初步应用

目的 :用基因工程方法获得小鼠VEGFR - 2 (Flk - 1)胞外段与配体结合区域的重组蛋白 ,并对其应用进行初步的探讨。方法 :将经PT -PCR扩增的目的序列组建到原核表达载体并诱导目的蛋白的表达 ,经纯化后的重组蛋白制备成疫苗 ,免疫兔 ,获得抗血清 ,用ELISA和Westernblot方法对抗血清进行分析。结果 :目的蛋白在原核表达系统中得到了高效的表达 ,该疫苗能刺激兔产生抗重组蛋白和天然Flk - 1的抗体。结论 :该抗血清可用于Flk - 1的免疫学检测 ,也为该疫苗用于抗肿瘤血管生成治疗奠定了基础。