非洲爪蟾VEGF肿瘤疫苗治疗小鼠纤维肉瘤的研究

目的：探讨非洲爪蟾VEGF肿瘤疫苗免疫抗小鼠纤维肉瘤的作用.方法：采用BALB/c小鼠建立Meth A小鼠纤维肉瘤模型.实验肿瘤小鼠随机分成3个治疗组：非洲爪蟾VEGF（xVEGF）组、小鼠VEGF（mVEGF）组、生理盐水对照（NS）组.观察小鼠肿瘤生长、生存率和治疗的毒副反应,并检测抗自身mVEGF抗体、肿瘤微血管密度（microvessel density, MVD）.结果：xVEGF组肿瘤明显小于mVEGF组或NS对照组（P＜0.05）,xVEGF组小鼠生存率也明显高于mVEGF组或NS对照组（P＜0.01）.Western Blot检测发现异种蛋白质疫苗免疫的小鼠体内产生了抗自身mVEGF抗体,xVEGF组肿瘤MVD明显低于mVEGF组或NS对照组（P＜0.01）.结论：非洲爪蟾VEGF疫苗治疗可诱导纤维肉瘤小鼠产生抗自身VEGF免疫反应及抗肿瘤作用.     

重组非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达、纯化及鉴定

目的构建非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子重组表达载体，进行蛋白质原核表达，并对表达产物进行分离、纯化和鉴定。方法首先通过限制性核酸内切酶酶切及连接反应，构建非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达载体pET—xVEGF和pET—mVEGF。筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确性后，再转染感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导蛋白质表达。表达产物经Ni—NTA亲合层析及肠激酶特异性酶切进行分离纯化，最后用SDS—PAGE和蛋白免疫印迹法进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定等显示目的基因片段和阅读框架正确无误，表明非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达载体pET—xVEGF和pET—mVEGF、构建成功。重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达，分离纯化的表达产物xVEGF和mVEGF的纯度达到95％以上，其相对分子质量与预期值一致。抗小鼠VEGF抗体可特异性识别xVEGF和mVEGF。结论重组非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达、分离纯化及鉴定成功，为进一步研究异种VEGF蛋白质疫苗抗小鼠肿瘤模型奠定了基础。     

胰腺癌DPC4基因同源缺失的检测

目的：了解胰腺癌中DPC4基因抽源缺失情况，方法：用Trizol试剂从18例新鲜低温冻存的胰腺癌组织提取总RNA，用DPC4mRNA的特异引物DPCI（5' CGC CAT GGA CAA TAT GTC TAT TAGG3')和DPCII（5' GCT CTA GAC CTC AGT CTA AAG GTT GTGG3')进行逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR），再进行凝胶电泳分析。结果：RT－PCR检测发现，胰腺癌中DPC4基因的同源缺失率为22．2％，4例缺失均发生在中－低分化胰腺癌，而6例高分化腺癌则未检出同源缺失。结论：胰腺癌中DPC4的同源缺失率为22．2％，DPC4的缺失均发生在中－低分化胰腺癌中，提示DPC4的表达缺失与胰腺癌的分化程度之间存在一定关系。     

N-[2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基]甲氨酰甲基化甘露聚糖的合成

目的 研究N-[2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基]甲氨酰甲基化甘露聚糖(chol-AECM-mannan)合成的途径．方法 以甘露聚糖为原料，经过羧甲基化、甲氨酰化和缩合反应合成-种被胆固醇部分修饰的多聚糖化合物，即chol-AECM—mannan。结果 经过红外光谱(IR)和氢核磁共振谱(^1HNMR)检测证实了产物为胆固醇部分修饰的多聚糖化合物，(chol-AECM—Mannan)，而且甘露聚糖部分与胆固醇部分氢原子比例为100:5，即每一百个甘露糖单糖单位接有1．1个胆固醇，产率为24％。结论 此方法是合成chol-AECM-mannan的一个有效途径。     

假基因对肿瘤生物学行为影响及机制的研究进展

假基因是一类与编码基因高度相似但不能表达功能蛋白质的细胞内非编码基因,曾一度被认为是“化石基因”。随着人们对假基因调节功能的不断认识,假基因在恶性肿瘤发生发展中的作用逐渐得到了重视。本文从假基因对恶性肿瘤细胞生物学行为的影响方面对近年来的研究进行了回顾。一般认为,假基因可以通过其转录产物影响同源或非同源的编码基因表达,并通过多种机制调节肿瘤细胞生物学行为。假基因是否有其它影响肿瘤生物学行为的机制还有待研究。     

一个phiC31相互作用的蛋白：人锌指蛋白403功能分析

背景：phiC31是重要的基因治疗工具酶,其与细胞内蛋白的相互作用可能影响细胞内各种通路,从而关系到基因治疗的安全性。 目的：构建锌指蛋白403基因原核表达载体,观察其在真核细胞的表达情况。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2007-10/2008-12在复旦大学遗传工程国家重点实验室完成。 材料：大肠杆菌DH5α菌株及大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株均为实验室保存。 方法：用pLexA-phiC31作为“诱饵”,对人胎脑cDNA文库通过酵母双杂交进行筛查,分离阳性克隆。对锌指蛋白403基因构建原核表达载体并纯化鉴定。脂质体介导真核细胞进行转染并细胞定位观察。 主要观察指标：锌指蛋白 403的原核表达载体的构建、纯化及在真核细胞细胞质中定位的结果。 结果：酵母双杂交进行筛查后分离61个阳性克隆中,有1个包含17号染色体17q12上的基因序列,其具有一个锌指结构,故名锌指蛋白403。成功构建了锌指蛋白403的原核表达载体,并纯化组氨酸标记的锌指蛋白403。在真核细胞中,构建了绿荧光融合载体,证明了此蛋白在细胞质中的定位。 结论：实验结果发现了一个新的phiC31整合酶相互作用蛋白,成功构建了znf403基因的原核表达载体,znf403蛋白主要在细胞质中聚集和分布。     

结直肠癌疫苗研究进展

结直肠癌有广泛的抗原基础，针对这些抗原可以设计多种类型疫苗，近年来结直肠癌疫苗研究发展较快，在寻找新治疗靶点、疫苗联合应用、改变疫苗转运及接种方式等都取得了一定进展。现就结直肠癌疫苗的设计形式及研究进展作一综述。     

腺病毒介导的人CD40配体基因抑制裸鼠卵巢癌生长的实验研究

[目的]探讨重组腺病毒人CD40配体基因(Ad-hCD40L)对卵巢癌的治疗作用.[方法]建立卵巢癌裸鼠动物模型,检测腺病毒介导的人CD40配体基因对肿瘤生长的抑制作用.[结果]瘤内注射Ad-hCD40L明显抑制裸鼠卵巢癌生长,Tunel法检测和HE染色肿瘤组织石腊切片观察调亡细胞明显增多,并可见大量肿瘤细胞坏死.[结论]腺病毒介导的人CD40配体基因抑制裸鼠肿瘤生长,增强诱导肿瘤细胞调亡,为卵巢癌的基因治疗提供了新的途径.     

RNA干涉鼻咽癌细胞Raf-1基因表达的实验研究

目的 研究应用载体介导的RNA干涉技术特异性干扰Raf-1基因在鼻咽癌细胞株HNE1中的表达以及对其生物学行为的影响。方法 构建利用U6启动子转录功能的shRNA的载体，在U6启动子下游分别插入含针对Raf-1基因不同位点的特异性RNA干扰序列-67bp寡核苷酸片段，并编号命名为：pshuttle-Raf-1-a（225），pshattle-Raf-1-b（358）和pshuttle—Raf-1-c（474）。将构建的质粒通过脂质体转染人鼻咽癌细胞株HNE1，用RT—PCR分析Raf-1基因的mRNA的表达，流式细胞仪检测转染后HNE1细胞的凋亡率。结果 3种含有针对Raf-1基因不同特异性序列的质粒转染后均能干扰该基因在HNE1细胞中的表达，其中以pSIREN shuttle-Raf-1-b（358）作用最为明显。RT-PCR检测Raf-1基因mRNA表达量下降，流式细胞仪检测细胞凋亡率增加，达到65％。结论 应用载体介导的RNAi技术可特异性干扰Raf-1基因在鼻咽癌细胞HNE1中的表达，使该细胞凋亡率增加，Raf-1基因相对应的mRNA表达下降。     

人釉原蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 构建含人釉原蛋白(hAm)成熟肽基因的重组原核表达质粒,在大肠杆菌中表达重组人釉原蛋白,鉴定经纯化获得的融合蛋白.方法 利用限制性内切酶EcoR I和Sal I将hAm基因插入原核表达载体PGEX4T1,对重组表达质粒PGEX4T1-hAm进行双酶切和测序鉴定.选择测序正确的质粒转化E.coli.RosettaTM,用终浓度0.3 mmol/L的IPTG诱导表达带有亲和标记谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的重组hAm.经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-hAm,并通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定原核表达的重组hAm.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误.在大肠杆菌RosettaTM中经IPTG诱导表达并纯化得到的融合蛋白GST-hAm,经SDS-PAGE鉴定分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在,与预测一致;Western blotting证实该融合蛋白能被特异性抗hAm多克隆抗体识别.结论 成功构建含有hAm成熟肽基因的重组原核表达质粒,表达的融合蛋白GST-hAm可通过纯化获得,经鉴定为hAm.大量纯化的hAm成熟肽的获得为开展其功能研究奠定了基础.