模拟鼠伤寒脂多糖表位合成肽的初步研究

目的 探讨3种模拟LPS表位的合成肽的抗原性。方法固相合成模拟LPS表位的线性十二肽P12(GPPQW-FFSQPQL)、环七肽13a(SACPSWASFWCGG)和13b(SACFQFTYPAACGG),与钥孔嘁血蓝蛋白或蓝载体交联,ELISA鉴定合成肽-载体交联物与抗LPS抗体的反应性,竞争ELISA鉴定游离的合成肽对抗LPS抗体与LPS、表达LPS模拟位的阳性噬菌体克隆结合的抑制。结果合成肽-载体交联物可与LPS抗体结合;游离环七肽13a可抑制抗LPS单克隆抗体与LPS结合(IC50=125μg／mL)及抗LPS单克隆抗体与阳性噬菌体克隆K1的结合(IC50=15．6μg/mL);游离十二肽P12抑制抗LPS单克隆抗体与LPS结合(IC50=550μg/mL)及阳性噬菌体克隆P12与抗LPS单克隆抗体结合(IC50=375μg／mL);游离环七肽13b可抑制噬菌体克隆P4和LPS多克隆抗体的结合(IC50=31．25μg／mL)。结论模拟LPS表位的合成肽可模拟LPS表位的抗原性,环肽优于线性肽。     

抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。     

六味地黄药物血清对血管内皮细胞凋亡模型的保护作用

目的研究六味地黄方药物血清对血管内皮细胞(VEC)损伤模型的保护作用。方法利用30 %过氧化氢 (H2O2)和大肠杆菌内毒素(LPS)致VEC凋亡模型 ,观察了药物血清对凋亡模型VEC的保护作用,并通过细胞内Ca2 的变化 ,探讨其作用机理。结果六味地黄汤药物血清可减轻H2O2和LPS对VEC的损伤 ,抑制VEC凋亡发生 ,并可明显缓解LPS所致的胞内钙超载。结论六味地黄汤具有保护VEC凋亡模型的作用 ,这种作用与其缓解细胞内钙超载有关     

中性粒细胞增强类风湿关节炎滑膜细胞产生基质金属蛋白酶及其细胞侵袭力

目的：研究中性粒细胞表面CD147分子对类风湿关节炎（RA）成纤维样滑膜细胞（FLS）产生基质金属蛋白酶（MMP）及细胞侵袭力的作用。方法：取自关节镜或骨科手术治疗的RA、骨关节炎（OA）患者的滑膜组织，体外分离培养FLS，通过流式细胞术（FCM）检测细胞表面分子及形态学方法鉴定。采用全反式维甲酸（ATRA）诱导HL-60细胞（人早幼粒白血病细胞株）诱导中性粒细胞分化，并用硝基蓝四氮唑（NBT）还原反应测定其分化程度。进而以FCM测定分化前后的HL-60细胞及FLS表面CD147的表达，并通过明胶酶谱和重组基质侵袭实验检测分化前后HL-60细胞对FLS MMP表达和细胞侵袭能力的作用以及CD147拮抗肽（AP-9）对这种MMP表达和细胞侵袭能力的抑制作用。结果：成功建立了FLS分离培养和HL-60细胞分化的实验体系。培养的FLS具有典型成纤维细胞的形态，均一的高度表达CD90（〉98％）而不表达CD14。分化后的HL-60细胞CD147表达上调，RAFLS细胞CD147表达水平低于分化前及分化后HL-60细胞（P〈0．05）。明胶酶谱试验显示：①与OAFLS相比，单培养的RAFLS表达较高水平的酶原及活化形式的MMP-2（P〈0．05）；②分化前／后的HL-60细胞分别与FLS共培养，酶原及活化形式的MMP-2和MMP-9的表达水平较这些细胞单独培养均显著升高（P〈0．05），且分化后的HL-60细胞与FLS共培养酶原及活化形式MMP-2表达水平较分化前HL-60细胞与FLS共培养明显升高（P〈0．05）；③AP-9显著抑制两共培养组中MMP-2和MMP-9的上调作用（P〈0．05）。侵袭实验显示：RAFLS侵袭能力高于OA FLS（P〈0．05）；分化前后的HL-60均可增加RAFLS的侵袭能力（P〈0．05），且分化后强于分化前（P〈0．05）；AP-9可抑制这一促进作用，降低FLS的侵袭能力（P〈0．05）。结论：中性粒细胞可能通过CD147促进RA患者滑膜FLS MMP-2、MMP-9的表达和活化，增强FLS的侵袭能力，这种促进作用可被CD147拈抗肽所抑制，将为RA关节软骨和骨损伤机制和治疗的进一步研究提供了重要的线索。     

在光纤芯片上进行高速个体化全基因组测序

新近发展的在光纤芯片上做高通量测序的技术，可以将人类全基因组序列的测定时间由目前所用的10年时间缩短到100d。光纤芯片上的基因组测序结合了磁珠、乳液PCR和焦磷酸测序法等技术，利用光纤优良的表面性质和有效的加工工艺，将光纤制作成一种基因芯片。在芯片上用磁珠来耦联DNA、RNA等微量反应物。乳液PCR可以获得大量的不同的基因组DNA片段。乳液PCR和光纤芯片都是由于有了磁珠作为微量反应物的载体，从而可以将反应一再小型化。而这些技术的结合，工作效率是目前常规的测序方法的100多倍。成功实现了基因组测序反应小型化、高通量化的思想，大大降低了成本，减少了完成全基因组测序的时间。     

IL-10与疾病关系的研究进展

IL-10是一种重要的抗炎细胞因子,对多种免疫细胞功能均有抑制作用.这种细胞因子的特殊生理意义在于防止和抑制强大的特异和非特异性免疫反应和由此导致的组织损伤,同时IL-10可增强“清道夫”功能,并有助于诱导免疫耐受.IL-10的这些作用与疾病的发生有密切的联系,因此研究其分子机制和生物学特征对IL-10相关性疾病的免疫...     

细胞亲环素A对单核来源泡沫细胞功能的影响

目的:研究细胞亲环素A对单核来源泡沫细胞功能的影响,探讨细胞亲环素A(CypA)在动脉粥样硬化发病过程中的作用。方法:以氧化型低密度脂蛋白诱导,建立人单核细胞系(THP-1细胞)分化的泡沫细胞模型,采用油红O染色进行形态学鉴定。以不同浓度的重组人CyPA(50、100、200μg/L)刺激人单核来源的泡沫细胞,通过细胞黏附实验、基质侵袭实验和明胶酶谱实验检测在分化的过程中CypA作用前后,MMP的表达,细胞黏附和侵袭力的变化。进而用环孢素A(CsA)、HAb18 mAb、c7b8 f10以及HAb18 mAb联合c7b8 f10分别进行阻断实验,观察对泡沫细胞功能的抑制作用。结果:在单核向泡沫细胞分化的各阶段中,泡沫细胞MMP-2、9的表达,黏附基质和侵袭能力均较THP-1单核株和巨噬细胞显著增强(P<0.05);CyPA对泡沫细胞上述功能有促进作用,浓度100~200μg/L的作用效果最明显(P<0.05);以上拮抗剂均可不同程度阻断CypA作用于泡沫细胞前后的上调作用,其中以HAb18 mAb联合c7b8 f10的抑制作用最明显(P<0.05)。结论:CypA上调了动脉粥样硬化泡沫细胞MMP-2、9的表达及其活性,增强了泡沫细胞黏附、侵袭能力,其促进作用可被CypA和CD147的拮抗剂所抑制。这一作用机制可能与动脉粥样硬化斑块不稳定性的发病机制相关联,并为其治疗提供了新的理论基础。     

基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用

目的构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体。方法通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列;通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体。为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的整合型酿酒酵母工程菌。提取该工程酵母的基因组,通过紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的特异引物进行扩增,确认紫穗槐-4,11-二烯合酶基因是否已整合到酵母基因组上。发酵酵母工程菌,对发酵产物进行GC—MS检测,确认是否产生紫穗槐-4,11-二烯。结果构建了1个酵母整合载体,具有如下特点：①能将外源基因表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上,增加目的基因的拷贝数;②选择标记能反复应用,方便获得多拷贝的整合形式;③整合片段不需要酶切线性化,节省了内切酶,而且简化了操作程序。酵母基因组PCR结果表明,紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上。以朱栾倍半萜为标准品,对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行GC—MS检测,发现其能产生紫穗槐-4,11-二烯,产量达到（91．33±7．57）mg／L朱栾倍半萜当量。结论初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载体。     

人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库的构建及质量分析

目的: 各种病因引起的心脏瓣膜纤维化是导致心脏瓣膜功能丧失的主要原因,样本来源有限和不可重获性是其分子机制研究的瓶颈。本研究旨在成功获取患者纤维化瓣膜的遗传信息物质,为探明瓣膜病变的分子机制提供直接证据。方法: 心脏换瓣手术中取纤维化瓣膜组织,提取高质量RNA,用SMART技术合成cDNA第1链,再用长距离PCR合成双链cDNA,经 Sfi I酶切后过柱分级收集长片段cDNA,经T4 DNA连接酶催化连接入λTriplEx2载体,最后经λ噬菌体包装后构建成原始文库,用PCR、X-gal等方法进行文库质量鉴定。 结果: 成功构建了纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,原始文库滴度为8× 10⁹ pfu/L,重组率为99%,外源基因片段大小在500到3 000 bp之间,其中81.25%片段大于1 000 bp。 结论: 成功构建了高质量的人类纤维化心脏瓣膜噬菌体表达文库,该文库的库容量足够代表人类基因的复杂性,高重组率能保障功能筛选的高效性,长片段更有助于全长基因的获得和表达。     

老年男性高血压病合并下肢动脉硬化症 危险因素的初步研究

目的 :本研究旨在探讨老年男性高血压病合并下肢动脉硬化症 (ｌｏｗｅｘｔｒｅｍｉｔｙａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓｄｉｓｅａｓｅ ,ＬＥＡＳＤ)的危险因素。方法 :根据我国 1 999年 3月颁布的最新高血压诊断标准 ,自 1 999年 3月～ 5月在30 1医院的住院患者中顺序入选曾确诊高血压病的 60岁以上男性患者共 65名 ,平均年龄 76 57± 5 89岁( 60～ 93岁 )。其中 38名患有ＬＥＡＳＤ(超声多普勒检查提示下肢动脉一处以上的动脉硬化斑块凸起及≥50 %管腔狭窄 ) ,平均年龄 77 76± 4 73岁 ,无ＬＥＡＳＤ患者 2 7名 ,平均年龄 74 89± 6 97岁…