深入加强莪术的基础与应用研究

目的：通过深入加强莪术的基础和应用研究,探讨莪术对机体的有效作用。方法：通过文献回顾总结归纳了莪术的药理作用及其机理,并提出深入加强莪术的基础与应用研究,应从两方面入手：（1）加强莪术治疗作用的机制研究;（2）在研究莪术药物疗效和机制的基础上进行有关方面的研究。结论：通过加强基础和应用的研究,莪术将对机体的代谢、生长发育、疾病的发生与发展起到越来越重要的作用。     

三重靶向介导的Smac过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡和周期进程的影响

目的：利用基因重组技术获得三重靶向性Smac过表达的条件复制型腺病毒,探讨其对乳腺癌MDA-MB-231细胞凋亡和周期的影响。方法：利用重组技术构建Smac过表达载体pShuttle-Egr1-Smac-HRE-hTERT-E1A-E1Bp-E1B55K,与骨架载体pAdEasy在BJ5183（AdEasy-1+）菌中进行重组,获得Smac过表达的条件复制型腺病毒CRAd.pE-Smac,感染MDA-MB-231细胞后,利用化学试剂氯化钴模拟肿瘤细胞乏氧状态,设立对照组、CARd.pE-Smac组、乏氧组和CARd.pE-Smac+乏氧组,并根据是否进行4 Gy照射,每组分为未照射组和照射组,共8个实验组。利用Western blotting法检测各组细胞Smac蛋白的表达,利用流式细胞术检测细胞凋亡率和不同周期进程细胞百分率。结果：Western blotting法检测,经条件复制型腺病毒CRAd.pE-Smac感染、乏氧和照射后,Smac蛋白表达水平增加,CARd.pE-Smac+乏氧+4Gy组Smac蛋白表达水平最高。流式细胞术检测,与对照组比较,CARd.pE-Smac组、乏氧组和CARd.pE-Smac+乏氧组细胞凋亡率均明显升高（P<0.05或P<0.01）;与相应未照射组比较,4 Gy照射后CARd.pE-Smac+4Gy组、乏氧+4Gy组和CARd.pE-Smac+乏氧+4Gy组细胞凋亡率均明显升高（P<0.05或P<0.01）,CARd.pE-Smac+乏氧+4Gy组升高最为明显,且S期和G₂/M期细胞百分率明显增加（P<0.05或P<0.01）,与诱导凋亡的结果有相似的趋势。结论：在条件复制型腺病毒CRAd.pE-Smac感染MDA-MB-231细胞、并经乏氧和辐射处理后,实现了三重靶向介导的Smac过表达,其具有促进肿瘤细胞凋亡和诱导G₂/M期细胞阻滞的作用。     

辐射对鼻咽癌放疗病人甲状腺功能的早期影响

目的探讨辐射对鼻咽癌病人甲状腺功能的早期影响,观察其临床症状、检测指标的诊断价值,为放射性甲状腺损伤的诊断提供依据。方法从2006年2月-2008年2月,42例鼻咽癌放疗照射野包括颈部甲状腺的病人为第一组,40例照射野包括下丘脑-垂体但不包括甲状腺的病人为第二组,分别在放疗前、放疗开始后1个月、2个月、3个月、6个月检测促甲状腺激素（TSH）、游离型T3（FT3）、游离型T4（FT4）,观察变化情况及临床症状。结果第一组病人在放疗前、放疗开始后1个月、2个月、3个月、6个月,中位TSH呈升高趋势,放疗开始后3个月、6个月高于放疗前,有统计学意义（P〈0.05）;各检测点的中位FT3、FT4呈降低趋势,放疗开始后3个月、6个月低于放疗前,有统计学意义（P〈0.05）;第二组病人各项指标未见趋势性变化和统计学意义;两组比较在放疗开始后3个月、6个月,第一组病人TSH高于第二组,FT3、FT4低于第二组,有统计学意义（P〈0.05）;两组病人均未见特异性甲状腺功能异常的临床症状。结论辐射早期即可导致甲状腺功能减退,且无特异性临床症状,很难单独根据临床症状做出诊断,因此甲状腺功能的定期检测是十分必要的。     

电离辐射对Beclin1过表达和低表达MCF-7细胞模型细胞自噬和凋亡的影响及其调控机制

目的:建立Beclin 1过表达和低表达MCF-7细胞模型,检测4 Gy照射后细胞自噬和凋亡的变化,探讨Beclin 1的分子调控作用机制。方法:实验分为MCF-7组、MCF-7+4Gy组、MCF-7-Beclin1+4Gy组和MCF-7-Belin1 RNAi+4Gy组。利用分子生物学方法构建Beclin 1过表达载体pcDNA3.1-Beclin 1,并建立Beclin 1过表达和低表达细胞模型。细胞经4 Gy照射后,采用MDC染色荧光显微镜观察自噬细胞百分比,AnnexinⅤ-FITC和PI染色流式细胞术检测凋亡细胞百分比,Western blotting法检测Beclin 1、P53、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果:与MCF-7组比较,MCF-7+4 Gy组、MCF-7-Beclin 1+4 Gy组和MCF-7-Beclin 1 RNAi+4 Gy组自噬和凋亡细胞百分比均明显升高(P<0.05 或 P<0.01),以MCF-7-Beclin 1+4 Gy组升高最明显,且高于MCF-7+4 Gy组 (P<0.05);各组坏死细胞百分比无明显差异。4 Gy照射后,MCF-7组和MCF-7-Beclin 1组细胞中Beclin 1、P53和Bax蛋白表达水平均升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,且以MCF-7-Beclin 1组最为明显。结论:成功建立Beclin 1过表达和低表达MCF-7细胞模型,电离辐射能够诱导其细胞自噬和凋亡,且对Beclin 1过表达细胞作用更明显。Beclin1通过激活P53,进而抑制Bcl-2和激活Bax,从而形成以P53为中心的自噬与凋亡分子调控机制。     

一氧化氮与电离辐射

一氧化氮(NO)的发现奠定了细胞信息传递的全新概念,即一个细胞产生的气体信号可穿透细胞膜调节另一个细胞的功能。NO具有独特的理化性质和生物学特性。体内NO是由L-精氨酸与O₂在NO合酶(NOS)的作用下合成的。NOS主要有3种亚型,即内皮型(eNOS)、神经元型(nNOS)和诱导型(iNOS),它们受Ca2+/钙调蛋白、磷酸化和NO的调节。NO生物学作用广泛,且具有双向性。NO在体外可引起细胞的辐射敏感性,但在体内主要具有辐射防护作用。     

褪黑素对小鼠胸腺细胞电离辐射损伤的防护作用

目的：探讨外源性褪黑素（MLT）对电离辐射所致小鼠胸腺细胞损伤的影响及其机制。 方法：通过腹腔注射方式给予昆明系小鼠外源性MLT,分别建立单次给药和连续给药两种动物模型。对于单次给药动物模型,腹腔注射不同浓度MLT后60 min给予1 Gy X射线全身照射,12 h后采用流式细胞术和荧光分光光度法分别检测胸腺细胞凋亡小体百分率和DNA裂解率的变化;对于连续给药动物模型,连续1周腹腔注射不同浓度MLT后给予1 Gy X射线全身照射,24 h后检测胸腺细胞数量及³H-TdR掺入率的变化。 结果：单次给药动物模型,小鼠受1 Gy X射线全身照射后12 h,胸腺细胞数显著低于假照组（P<0.001）,凋亡小体百分率和DNA裂解率显著高于假照组（P<0.001）。照射前预先给予外源性MLT,与0 mg•kg^-1 MLT组（单纯照射组）比较,胸腺细胞数增多,以0.5 mg•kg^-1 MLT组增多最明显（P<0.01）;凋亡小体百分率和DNA裂解率降低,在0.1~2.5 mg•kg^-1 MLT浓度范围内差异均具有显著性（P<0.001）。连续给药动物模型,小鼠受1 Gy X射线全身照射后24 h,胸腺细胞数及³H-TdR掺入率均显著低于假照组（P<0.001）。照射前预先给予外源性MLT,与单纯照射组相比,胸腺细胞数和³H-TdR掺入率均显著增多,前者在0.01~0.10 mg•kg^-1 MLT浓度范围内差异具有显著性（P<0.01）,后者在0.1~1.0 mg•kg^-1 MLT浓度范围内差异均有显著性（P<0.05）。 结论：照射前预先给予外源性MLT可减轻电离辐射所致小鼠胸腺细胞损伤,对小鼠免疫功能具有保护作用。     

电离辐射对Jurkat T细胞凋亡与坏死的影响

目的：研究电离辐射诱导Jurkat T细胞凋亡与细胞坏死的变化规律,探讨电离辐射作用后细胞的死亡模式与机理。方法：采用Annexin V-EGFP和PI 双染、流式细胞术(FCM)检测不同剂量（0.075、0.500、1.000、2.000、4.000和6.000 Gy）X射线照射后Jurkat T细胞凋亡与细胞坏死的时间-效应关系和剂量-效应关系。结果：时间-效应关系,2.000 Gy X射线照射后,与假照组比较,Jurkat细胞凋亡百分率在照射后18 h显著增加,至24 h始终维持在较高水平（P＜0.001）;细胞坏死百分率于照射后4 h显著增加,12 h 达峰值,至48 h始终维持在较高水平（P＜0.001）。剂量-效应关系,0.075Gy X射线照射后18 h,Jurkat T细胞凋亡百分率和细胞坏死百分率与假照组相比较未见明显变化（P＞0.05）。2.000~6.000 Gy较大剂量X射线照射后18 h,细胞凋亡百分率和细胞坏死百分率与假照组比较均呈剂量依赖性增加（P＜0.001）。结论：2.000 Gy以上剂量X射线可以诱导Jurkat T细胞发生凋亡和坏死,细胞坏死比细胞凋亡出现时间更早,持续时间更长。     

Taurolidine诱导小鼠黑色素瘤B16-4A5细胞凋亡

目的:探讨Taurolidine对小鼠黑色素瘤B16-4A5细胞的生长抑制及其诱导凋亡的作用机制。方法: MTT法检测Taurolidine对B16-4A5细胞生长的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blotting检测Bcl-2家族蛋白表达水平,ApoTarget试剂盒检测caspase-9活性。结果:Taurolidine对小鼠B16-4A5细胞生长有显著的抑制作用,并能显著诱导细胞发生凋亡,其作用呈明显的量效和时间依赖性关系。Taurolidine能明显提高促凋亡蛋白（Bax和Bad）表达水平,抑制抗凋亡蛋白（Bcl-2）水平。结论: Taurolidine通过调节Bcl-2家族蛋白及激活caspase-9诱导小鼠B16-4A5黑色素瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖。     

Citicoline对大鼠中脑原代细胞培养的神经保护作用

目的：探讨胞二磷胆碱（citicoline,CC）对6-OHDA诱导的帕金森体外细胞模型的保护作用及其机理。方法：孕15 d大鼠胚胎中脑原代培养,在培养第6 、8及10天,实验组加不同浓度CC（2、1、0.1、0.01和0.001 mmol·L^-1 ）,并于第11天加50 μmol·L^-1的6-OHDA作用0.5 h,制作帕金森病细胞模型;6-OHDA组为原代培养细胞加50 μmol·L^-1的6-OHDA;对照组为原代培养细胞。培养11 d收集细胞。采用MTT法测细胞活力,通过流式细胞仪,用Fluo3/AM检测细胞内Ca²⁺i及用罗丹明123检测线粒体膜电位（Δψm）。结果：2、1和0.1 mmol·L^-1 CC组,细胞活力与对照组比较明显增高,并随着浓度的增加而增加,差异具有显著性(P<0.05)。1、0.1、0.01 和0.001 mmol·L^-1 CC+6-OHDA组,细胞活力均高于6-OHDA组,差异有显著性（P<0.01）。1、0.1、0.01、0.001 mmol·L^-1 CC+6-OHDA组细胞内Ca²⁺i均明显下降,分别为(32.23±1.87)%、(17.09±7.45)%、(21.71±8.89)%及(29.18±4.71)%,与6-OHDA组（49.30±7.62）%相比,差异均有显著性（P<0.01）;与对照组（42.40±0.81）%比较明显下降,差异均有显著性（P<0.01）。CC+6-OHDA各组与6-OHDA组比较均使Δψm升高,其中1 mmol·L^-1CC+6-OHDA组Δψm高于对照组,差异有显著性（P<0.01）。结论：CC通过保护神经元细胞膜、增加细胞活力、降低细胞内Ca²⁺i以及提高Δψm,发挥其对神经元的保护作用。     

p53基因突变子175 H、248 W和273 H的定点突变及表达载体的构建

目的：定点诱变合成p53基因突变子进而构建表达载体。 方法：以野生型p53基因为模板,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,将突变位点设 计在引物上,通过重叠延伸法2次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩 增片段克隆入pcDNA3.1载体中。 结果：在预期位点已经发生突变,p53基因第175位密码子由精氨酸（cgc）突变为组氨酸（cac）,第248位密码子由精氨酸（cgg）突变为色氨酸（tgg）,第273位密码子由精氨酸（cgt）突变为组氨酸（cat）。p53基因突变子表达载体成功构建。 结论：PCR技术诱导定点突变准确、高效。基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位 点奠定了基础。