同源性骨肉瘤新细胞系Zos和Zos-M的生物学比较研究

目的 对来源于同一患者原发灶和跳跃转移灶的两株新建骨肉瘤细胞系-Zos和Zos-M的特性和生物学行为进行鉴定和比较研究.方法 用组织培养块法从1例骨肉瘤患者原发灶和跳跃转移灶骨肉瘤组织,分离并分别建立两株新的骨肉瘤细胞系-Zos和Zos-M;利用形态学观察、核型和细胞周期分析、生长曲线和倍增时间检测、成骨性标志检测和基质胶侵袭试验对两株细胞系进行体外鉴定.通过皮下、原位移植和实验性转移检测细胞系的体内成瘤和转移能力.应用MTT法检测Zos和Zos-M对传统化疗药物的敏感性;RT-PCR方法检测并比较二者转移相关基因的表达.结果 Zos和Zos-M体外连续培养100代后仍保持稳定,形态学检测、RT-PCR检测碱性磷酸酶、骨钙蛋白和骨桥蛋白等成骨系标志提示均符合骨肉瘤特征.Zos和Zos-M倍增时间分别为33.65 h和31.58 h.核型分析表现为非整倍体和多种染色体结构异常.Zos、Zos-M皮下和原位成瘤率均为100%,Zos-M实验性转移率为37.5%(3/8),Zos无实验性转移(0/8).转移相关基因表达检测表明cadherin-11在Zos-M的低表达可能与其高转移能力相关.并且Zos和Zos-M与传统骨肉瘤细胞系相比,对常用化疗药物的敏感性差.结论 人骨肉瘤细胞系Zos和Zos-M及相关动物模型的建立为治疗骨肉瘤的药物筛选提供新的模型,其具有相同的遗传背景和不同的侵袭转移能力,为骨肉瘤转移的研究提供良好的模型.

Abstract：

Objective To characterize and compare the different biological behaviors of two novel human osteosarcoma cell lines, Zos and Zos-M, established respectively from the primary site and the skip metastasis of an osteosarcoma patient. Methods Two novel human osteosarcoma cell lines, Zos and Zos-M,were developed using tissue plant culture method. The vitro examinations included observations of morphology, analysis of karyotype and cell cycle, calculation of doubling time and growth curve, detection of osteoblastic markers and matrigel invasion assay. Subcutaneous, intratibial and intravenous inoculations into nude mice were performed to study the in vivo tumorigenicity and metastatic potentials of both cell lines.MTT were used to detect sensitivity of the cell lines to chemotherapeutic drugs. RT-PCR was performed to assess the expression of and some metastasis-related genes. Results Both cell lines proliferated actively and remained stable for more than 100 passages in vitro without interruption. The morphology and expression of osteoblastic markers of Zos and Zos-M were conformed to the characteristic of osteosarcoma. The karyotype analysis displayed aneuploidy and various structural abnormalities. The population doubling time of Zos and Zos-M were 33.65 h and 31.58 h respectively. Both cell lines were less sensitive to the current chemotherapy protocols compared to U-2OS. Zos and Zos-M were 100% tumorigenic by subcutaneous and othotopic injection. 37.5% of nude mice injected Zos-M and none of nude mice injected Zos developed lung metastasis after intravenous injection. The comparison of the expression patterns of some metastasis-related genes revealed that the decreased expression of cadherin-11 in Zos-M may correlate with a high potential of metastases. Conclusion The two novel established human osteosarcoma cell lines, Zos and Zos-M and related animal models could serve as models for the study of drug resistance and screening of new therapeutics for osteosarcoma. In addition, the study also provide tools for the study of metastasis because the same genetic background and different potential of metastasis of Zos and Zos-M.     

硫化氢抑制顺铂致人骨髓间充质干细胞的损伤

背景：在使用顺铂进行化疗时,常因造血干细胞损伤造成严重的骨髓抑制,而目前临床上还没有一种有效的化疗细胞保护剂来减轻其不良反应。 目的：探讨硫化氢对顺铂致人骨髓间充质干细胞损伤的保护作用。 方法：应用硫氢化钠作为硫化氢的供体,用不同浓度的硫氢化钠与顺铂同时作用于人骨髓间充质干细胞48 h后,甲氮甲唑蓝法(MTT)检测细胞存活率,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,Western blot检测蛋白的表达。 结果与结论：MTT检测发现顺铂可降低骨髓间充质干细胞的存活率,硫氢化钠可呈浓度依赖性的对抗顺铂对人骨髓间充质干细胞生长的抑制作用,0.5,1 mmol/L 硫氢化钠与20 mg/L顺铂共同作用人骨髓间充质干细胞48 h后会引起NF-κB(p65)上调和IκB-α的下调,1 mmol/L 硫氢化钠与20 mg/L顺铂在作用6 h后磷酸化蛋白激酶1/2明显上调。结果提示,硫化氢可能通过蛋白激酶-NF-κB信号通路来抑制顺铂致人骨髓间充质干细胞的损伤作用。     

Tet-on基因表达系统转染骨髓基质干细胞和诱导调控效应检测

目的 探讨利用Tet-on基因表达系统调控目的基因在骨髓基质干细胞中表达的可能性和量效关系，为利用该系统调控BMP基因在骨髓基质干细胞中的表达奠定基础。方法 以荧光素酶（luciferase)基因为目的基因，应用Lipofectamine介导的瞬间转染方法。将pTet-on调节质粒和pTRE-luciferase反应质粒共转染骨髓基质干细胞，加入系列浓度的强力霉素（doxycyline)后，观察doxy-cyline的诱导效应。结果 （1）pTet-on表达系统质粒DNA经HindⅢ单酶切，琼脂糖凝胶电泳后，可见6.02kb和1.38kb两个片段；pTRE-luciferase质粒经HindⅢ单酶切线性化，可见5.2kb的片段，均符合质粒图谱。（2）随着doxycyline浓度的增加，荧光素酶的活性也逐渐增加，未转染的骨髓基质干细胞虽经doxycyline诱导，但其RLU值与空白对照（蒸馏水）非常接近，说明未转染的骨髓基质干细胞不受doxy-cyline诱导，而转染的骨髓基质干细胞在未加入诱导剂量，其RLU（relative-luciferase-unit)值也接近空白对照值。结论 转染Tet-on基因表达控制系统的骨髓基质干细胞对doxycyline诱导具有较好的反应性，目的基因荧光素酶基因的表达效力对doxycyline具在严格的计量依赖关系。因此，利用Tet-on基因调控系统对目标基因在骨髓基质干细胞中的表达进行调控是可行的。     

骨肉瘤保留肢体治疗术后生存分析

目的：探讨骨肉瘤保肢治疗中肿瘤大小,临床分期,手术方式,术前,术后化疗以及肿瘤多药耐药基因表达产物Ｐ糖蛋白对术后生存时间的影响。方法：统计分析和７年４７例骨肉瘤保肢术患者的病理,临床资料及生存时间,并用链菌素０－生物素标记法免疫组织化学法回顾 检测肿瘤标本中Ｐ－１７０糖蛋白。结果：临床分期为ⅡＢ期患者１－５年生存率分别是９７．４％,７６．０％,４６．３％,３８．９％和３４．０％,ⅡＡ期患者相应的生     

硫化氢抑制顺铂致人骨髓间充质干细胞的损伤

背景：在使用顺铂进行化疗时,常因造血干细胞损伤造成严重的骨髓抑制,而目前临床上还没有一种有效的化疗细胞保护剂来减轻其不良反应。目的：探讨硫化氢对顺铂致人骨髓间充质干细胞损伤的保护作用。方法：应用硫氢化钠作为硫化氢的供体,用不同浓度的硫氢化钠与顺铂同时作用于人骨髓间充质干细胞48h后,甲氮甲唑蓝法（MTT）检测细胞存活率,Hoechst33258染色检测细胞凋亡,Western blot检测蛋白的表达。结果与结论：MTT检测发现顺铂可降低骨髓间充质干细胞的存活率,硫氢化钠可呈浓度依赖性的对抗顺铂对人骨髓间充质干细胞生长的抑制作用,0.5,1mmol/L硫氢化钠与20mg/L顺铂共同作用人骨髓间充质干细胞48h后会引起NF-κB（p65）上调和IκB-α的下调,1mmol/L硫氢化钠与20mg/L顺铂在作用6h后磷酸化蛋白激酶1/2明显上调。结果提示,硫化氢可能通过蛋白激酶-NF-κB信号通路来抑制顺铂致人骨髓间充质干细胞的损伤作用。     

槲皮素诱导耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞系U2-OS/MTX300凋亡

 【目的】 研究槲皮素对耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞株U2-OS/MTX300的增殖抑制和诱导凋亡作用及相关机制。【方法】 以不同浓度槲皮素及甲氨蝶呤处理U2-OS及U2-OS/MTX300。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及平板克隆检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Hochest 33258 染色及流式细胞仪检测凋亡,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved-PARP,Bax,Bak,Bcl-2及Bcl-XL表达。【结果】 槲皮素可明显抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞U2-OS/MTX300的增殖,72 h IC50值为(22 ± 4)μmol/L、10、25、50μmol/L可显著抑制U2-OS/MTX300克隆形成数量,且随剂量增加抑制作用明显增强。槲皮素与甲氨蝶呤之间不存在交叉耐药性。槲皮素能诱导U2-OS/MTX300细胞S期阻滞,并可诱导胞内产生典型凋亡小体,流式细胞仪可检测到明显凋亡。其作用机制是通过上调Bax,Bak及下调Bcl-2表达,促进cytochrome C释放及诱发PARP等重要胞内蛋白断裂来实现。【结论】 槲皮素可显著抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞系U2-OS/MTX300细胞增殖并诱导其凋亡,线粒体途径可能是其诱导凋亡的重要机制。     

带血管蒂腓肠肌内侧头肌瓣转移重建髌腱的长期随访

Objective To evaluate the long following-up outcome of the medial gastrocnemius muscle transferring reconstruction the patella tendon after the wide resection of aggressive bone tumors in the proximal tibia. Methods With the 69 patients of the osteogenetic sarcoma in the proximal tibia were treated with the wide resection and reconstruction the patella tendon. After the long following up the knee extensor,function and complications were evaluated. Results With the 69 patients, the 45 survival patients were followed up for the average 68.6 (24-128) months. The local recurrence rate was 8.7%(6/69). The strength of knee extending was in the average of grade 4.2(3.6-5.0), the degree of knee flexion was in the average of 95°(75°-135°), the degree of knee extension was in the average of-2°(0°-12°), the knees of five patients cannot fully extension. The MSTS functional score was in the average of 77% (23.1/30). Conclusion During the limb salvage of the proximal tibial aggressive bone tumors, the medial gastrocnemius muscle transferring reconstruction the patella tendon could offer the knee extension strength; improve the soft tissue coverage and functional results.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂PCI-24781诱导耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞U2-OS/MT300凋亡

目的研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂PCI-24781诱导耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞凋亡的作用及机制。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及平板克隆形成实验检测PCI-24781对骨肉瘤细胞U-20S/MTX300增殖的影响,hochest33258染色检测PCI-24781处理后细胞核形态改变,流式细胞仪检测凋亡,Western blot法检测cleaved-PARP、P53表达量及组蛋白H3、H4乙酰化水平变化。结果PCI-24781对耐甲氨蝶呤U2-OS/MT 300细胞呈剂量依赖性增殖抑制,其48 h IC50值为(0.55±0.03)μmol.L-1,该值与甲氨蝶呤敏感U2-OS细胞IC50值之间无统计学差异(P>0.05)。0.5μmol.L-1PCI-24781可显著抑制细胞克隆形成,其抑制率达(61±7)%。PCI-24781处理48 h后细胞内出现典型凋亡小体,流式细胞仪检测凋亡率达(29±4)%。Western blot检测可见随PCI-24781浓度升高cleaved-PARP,组蛋白H3、H4乙酰化水平及P53显著升高。结论组蛋白去乙酰化酶抑制剂PCI-24781可显著抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡,其作用机制与上调组蛋白乙酰化水平,促进抑癌基因P53表达有关。     

81例四肢病理性骨折的外科治疗

目的总结分析病理性骨折的临床治疗方法及其合理性。方法回顾性分析2003年6月至2006年6月中山大学第一附属医院骨肿瘤科手术治疗四肢病理性骨折81例。统计分析病理陛骨折的不同病因特点，临床特征及采用不同临床治疗方法的必要性和合理性。结果病理性骨折发生于8-74岁不同年龄的患者，平均年龄38．6岁。骨折病因依次为转移性肿瘤32例（39．6％），原发恶性肿瘤27例（33．4％），良性肿瘤22例（27．2％）；下肢57例（70．4％），上肢24例（29．6％）；29例（35．8％）合并有肺或其他部位转移。81例均接受手术治疗，术后随访时间6～36个月，平均32个月。76例（93．8％）术后能扶拐行走，其中45例（55．6％）3个月后正常行走，6例（7．3％）1年内死亡，13例（16．1％）3年内死亡。结论病理性骨折为临床常见病，不同病因有不同临床特征及应采用不同的治疗方法；掌握其不同临床特点，采用合理、优良有效的治疗方法是良好预后的关健。     

老年心脑血管疾病心肌灌注、左室射血分数与认知相关性及随访研究

目的了解老年缺血性心脑血管疾病患者心肌血流灌注及左室射血分数(LVEF)对认知功能的影响。方法对68例老年缺血性心脑血管疾病患者进行心肌血流灌注SPECT检查,同时应用MMSE量表、CISA量表和临床记忆量表检测认知功能。并于12个月后进行随访,动态监测心肌血流灌注和认知功能发展情况。结果心肌血流灌注与认知功能无明显相关,而LVEF与认知记忆能力,如记忆商、指向、联想及人像分测验成绩呈正相关(r=0.411,0.406,0.343,0.439,P<0.05)。随访研究发现总体样本和冠心病组的平均心肌灌注水平下降明显(P<0.05);CISA测验中多项得分(B因素、D因素、言语商、操作商、拼块、词义辨析、图画找错和背数)显著降低(P<0.05),分组后冠心病组和脑血管病组认知得分下降均明显。结论心功能的下降对老年缺血性心脑血管疾病患者的认知功能影响甚大。