H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞表位预测及抗原性分析

目的:预测H5N1亚型禽流感病毒血凝素Th和B细胞相关抗原表位,并初步分析其抗原性.方法:依据近年H5N1亚型禽流感病毒流行趋势,下载得到相关HA蛋白氨基酸序列.进行生物信息学综合分析预测,获得Th和B细胞相关抗原表位,并比较其保守性和特异性.通过BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清,初步鉴定候选表位抗原性.结果:综合多项预测及空间构象模拟结果,我们获得了三条候选Th和B细胞表位,分别为HA141～155、HA206～223、HA302～316.候选表位处于H5N1亚型禽流感HA1 蛋白序列上相对保守的区域内,且与目前流行的H5N1亚型禽流感病毒HA相应区域具有较好的一致性.而不同候选表位在BALB/c小鼠和SPF鸡H5N1亚型禽流感病毒阳性血清反应中显示了不同抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能.结论:所筛选的表位具有成为H5N1亚型禽流感病毒HA Th和B细胞相关抗原表位的可能.本研究为深入揭示流感病毒感染与免疫机制,H5N1亚型禽流感功能表位认知及表位疫苗研究奠定了基础.     

双亚型(H5/H7)流感病毒DNA疫苗的构建及其免疫原性检测

目的：构建双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗,并检测其免疫原性。方法： 构建共表达流感病毒H5亚型血凝素(HA)和H7亚型HA的DNA疫苗,采用间接免疫荧光法(IFA)检测目的蛋白在幼仓鼠肾细胞(BHK cell)中的表达。分为pVAX1-H5-H7、pVAX1-H5、pVAX1-H7和pVAX1空质粒对照组4组（每组15只）进行小鼠免疫实验,并应用ELISA法检测小鼠血清抗体,流式细胞术检测小鼠脾T淋巴细胞亚群数量。结果：所构建的双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗在BHK细胞中的表达产物可激发荧光抗体产生绿色免疫荧光,且对照pVAX1空载体转染BHK细胞无免疫荧光产生。使用双亚型（H5/H7）流感病毒DNA疫苗免疫小鼠后,小鼠产生了针对H5和H7抗原的血清特异性抗体,流式细胞术检测免疫组小鼠脾T淋巴细胞亚群CD4+和CD8+的数量显著高于对照组（P<0.05）。结论： 成功构建的双亚型（H5/H7）流感病毒 DNA疫苗可以诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答。     

山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法的建立

目的 在mRNA 水平对山羊Th1/Th2型细胞因子进行定量分析,建立山羊Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量检测方法。方法 根据GenBank山羊Th1(IL-2和IFN-γ)和Th2(IL-4、IL-6和IL-10)细胞因子基因保守序列设计引物,以标准阳性质粒为模板分别进行荧光定量PCR反应的标准曲线、溶解曲线建立。结果 山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测方法Ct值与标准品呈良好的线性关系,R²均大于0.985,所有稀释度标准品模板出现特异性熔解峰;利用N1蛋白缺失的重组山羊痘病毒(△N1L株)与山羊痘AV41株感染山羊外周血淋巴细胞进行IL-4和IFN-γ mRNA 表达水平检测,△N1L株与山羊痘AV41株均能能够刺激机体IL-4和IFN-γ细胞因子,但二者差异无统计学意义(t=3.333,P>0.5)。结论 本研究建立山羊Th1/Th2细胞因子实时荧光定量检测,为山羊痘基因工程疫苗的研究奠定基础。     

口蹄疫重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1的构建与理化学特性研究

目的 构建含有口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体PI-2A和蛋白酶3C基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗并研究其理化学特性。方法选用鸡痘病毒作为载体，将FMDV的衣壳蛋白前体P1—2A和蛋白酶3C基因插入到鸡痘病毒表达载体中，构建重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL3CP1，并与鸡痘病毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞，通过药物BrdU加压筛选、间接免疫荧光实验以及Western blot等方法筛选并获得了一株重组鸡痘病毒。将其经酸、碱、加热、氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理，接种到CEF上观察处理前后口蹄疫重组活载体疫苗vUTAL3CP1细胞病变，分析这些理化因子对口蹄疫重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1重组鸡痘病毒的影响。结果 在pH3．0～9．0范围内，pH值变化不会造成该口蹄疫重组活载体疫苗vUTAL3CP1毒价的显著变化；口蹄疫重组活载体疫苗VUTAL3CP1经50℃60min、55℃30min或60℃15min即可被灭活；对氯仿敏感；经胰蛋白酶37℃作用1h，毒价降低2．44log10TCID50对乙醚有抵抗力，经乙醚作用24h病毒滴度下降1．0log 10TCID50结论 筛选并鉴定了含有口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P12A和蛋白酶3C基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗vUTAL3CP1，为疫苗研制奠定基础。     

口蹄疫感染与免疫动物鉴别诊断方法的建立

目的建立鉴别自然感染口蹄疫动物和口蹄疫灭活疫苗免疫动物的诊断方法。方法构建重组杆状病毒的转座质粒pFastBac-3AB,转化DH10 Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒Bacmid-3AB;将Bacmid-3AB转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒。以重组杆状病毒表达的3AB蛋白为抗原建立鉴别口蹄疫感染与免疫动物的ELISA诊断方法,并对各种反应条件进行优化,包括抗原包被时间、包被浓度、封闭剂、酶标抗体工作浓度等。结果获得了重组杆状病毒,成功表达了口蹄疫病毒3AB蛋白,并用纯化的3AB蛋白建立了检测口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法。用该方法检测FMDV感染动物和免疫动物血清抗3AB蛋白抗体,猪和牛感染血清检测的阳性率分别为83.3%和91.7%。结论用纯化的口蹄疫病毒3AB蛋白建立了鉴别诊断口蹄疫感染与免疫动物的ELISA诊断方法。     

寨卡病毒E蛋白的原核表达及鉴定

目的应用原核表达载体pET-28a表达ZIKV主要结构蛋白E蛋白,并对反应条件进行优化,为ZIKV亚单位疫苗的研究奠定基础。方法从GenBank检索ZIKV基因组,合成E基因并进行密码子优化,以提高原核表达效率。设计引物,以合成的E基因为模板PCR扩增ZIKV E基因,用BamHI和HindIII进行双酶切后连接表达载体pET-28a,构建原核表达重组质粒pET28a-ZIKV E,转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行目的蛋白的表达,并对最适IPTG诱导浓度进行优化。结果 pET28a-ZIKV E经酶切及测序鉴定均构建正确。用重组质粒转化DE3,当加入IPTG终浓度为2mmol/L,成功表达出分子质量单位(Mr)为56×103重组ZIKV E蛋白,与理论分子质量相符合。Western blot检测重组蛋白可被His标签抗体识别。结论成功构建原核重组载体pET-28a-ZIKV E,表达的重组蛋白具有免疫反应性,为ZIKV亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒构建

目的 构建表达H3、H5、H7、H9亚型流感病毒通用多表位重组鸡痘病毒活载体疫苗候选株.方法 筛选流感病毒主要抗原(HA NA NP M)优势抗原表位基因,以生物信息学软件优化其排列结构合成流感多表位基因(Epi),以H5、H7 HA融合表达基因为骨架,将多表位基因插入构建H7HA-Epi-H5HA阅读盒,定向克隆至鸡痘病毒表达载体pUTA-2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游,构建重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA.应用脂质体介导的转染法,将该重组鸡痘病毒中间转移载体与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经BrdU进行3次加压筛选挑斑纯化后传代,并对重组以鸡痘病毒进行PCR和IFA检测和Western blot分析.结果 成功构建了重组鸡痘病毒中间转移载体pUTA-2-H7HA-Epi-H5HA,PCR、IFA和Western blot检测阳性.结论 筛选出稳定共表达H5H7HA基因和通用多表位基因的重组鸡痘病毒vUTA2-H7HA-Epi-H5HA株,该重组鸡痘病毒的构建为跨种通用型流感病毒活载体疫苗的研究奠定了物质基础.