再生障碍性贫血患儿CD+4CD+25T细胞及TGF β1Flt 3L水平变化的意义

目的评价免疫调节T细胞和细胞因子在再生障碍性贫血(再障)细胞免疫功能紊乱中的作用。 方法2004 02—2005 06中山大学第二附属医院采用流式细胞术检测27例特发性再障患儿骨髓及外周血淋巴细胞亚群和CD+4CD+25T细胞水平，ELISA检测骨髓转化生长因子(TGF β1)和Flt 3L水平，并与正常儿童对照。 结果与对照组比较，初诊再障患儿外周血和骨髓CD+8T细胞均显著增高(P<0.05)，重型再障(SAA)组伴外周血CD-3CD+56NK细胞及骨髓B细胞显著下降(P<0.05)。初诊SAA组骨髓CD+4CD+25T细胞\[(7.5±3.4)%\]显著高于对照组\[(4.3±0.9)%，P<0.05\]，初诊SAA组及轻型再障(MAA)组骨髓CD+4CD+25/CD+4比值分别为(28.9±11.1)%和(28.2±9.4)%，均显著高于对照组\[(17.4±0.9)%，P均<0.05\]，骨髓TGF β1分别为(2.2±1.7)μg/L和(2.0±0.6)μg/L，均较对照组［(4.4±0.9)μg/L］显著降低(分别为P<0.01、P<0.05)，而Flt 3L水平分别为(1031.1±321.8)ng/L和(694.7±424.7)ng/L，均较对照组［(63.0±37.5)ng/L］显著增高(P均<0.01)。缓解期SAA儿童除外周血CD+8T细胞仍较对照组显著增高外，其余上述指标均接近正常水平。相关分析显示，骨髓CD+4CD+25T细胞与CD+3CD+4T细胞呈显著正相关(r分别为0.495、0.540,P<0.01)；Flt 3L与骨髓CD+3、CD+4、CD+8T细胞及CD+4CD+25T细胞均呈显著正相关(r分别为0.732、0.542、0.688、0.405,P分别<0.01、0.01、0.01、0.05)，而TGF β1与骨髓CD+8T细胞和Flt 3L水平呈显著负相关(r分别为-0.431、-0.482,P分别<0.05、<0.01)。 结论儿童再障发病与CD+4CD+25T细胞数量缺乏无关，骨髓TGF β1水平显著降低和Flt 3L水平显著增高可能在再障儿童T淋巴细胞数量增多和功能紊乱中起重要作用。     

米非司酮用于紧急避孕(附30例临床观察)

自1998年10月至1999年9月,我院对要求紧急避孕的部分妇女给予口服米非司酮,取得满意效果,报告如下. 1 资料与方法 1.1 一般资料本组30例均处于易孕期,无口服米非司酮禁忌证,在性生活后72 h内就诊.其中12h内就诊者20例,24 h内者5例,48 h内者3例,72h内者2例;未采取避孕措施者29例,避孕套破裂或滑脱者10例;年龄20～45岁,平均年龄30岁,月经周期均规律(28～30 d).     

中和试验发现西安地区为肾综合征出血热混合型疫区

目的 调查陕西西安地区汉坦病毒感染现状,分析当地肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)疫源地性质.方法 根据HFRS发病报告数据,分析西安HFRS的发病特点.通过荧光定量RT-PCR方法,检测西安HFRS疫区家鼠和野鼠携带汉坦病毒情况及病毒型别.微量中和试验确定西安本地HFRS病人、HFRS疫苗接种者和隐性感染者血清中的汉坦病毒中和抗体水平并分型,回顾性调查阳性感染者.结果 西安地区HFRS发病每年均有6-7月份的小高峰和10-12月份的大高峰;在当地642只家鼠和1 546只野鼠肺组织中检出汉滩病毒RNA136份;143份人血清中123份检测到汉坦病毒中和抗体,未检测到中和抗体的有20份.中和抗体阳性者中判定为汉滩病毒感染者92人,占74.80％;判定为汉城病毒感染者3人,占2.44％;不能区分病毒感染型别者28人,占22.76％,3例感染汉城病毒者分别为HFRS病人、疫苗接种者和隐性感染者,调查显示3例均为本地感染.结论 实验室和现场调查证实当地存在汉城型病毒本地感染,陕西西安地区是以汉滩病毒型为绝对优势的HFRS混合型疫区.     

慢性乙型肝炎患者外周血树突细胞CD40、CD80表达和免疫活性的体外研究

目的 :探讨慢性乙型肝炎患者DC表面协同刺激分子CD4 0和CD80表达与其抗原呈递功能的关系 ,为进一步研究慢性乙型肝炎的发病机制及治疗提供新的思路。方法 :分离培养慢性乙型肝炎患者和健康人外周血DC ,流式细胞仪测定DC表面CD4 0和CD80的表达 ,混合淋巴细胞反应测定两组DC的功能。结果 :慢性乙型肝炎患者DC表面CD4 0和CD80的表达较健康人低 ,刺激同种异种T细胞增殖反应也较健康人低。结论 :乙肝病毒感染可通过抑制患者DC表面CD4 0、CD80等协同刺激分子的表达 ,从而使其抗原呈递功能降低     

间充质干细胞对脐血CIK／NK细胞CD69表达及培养体系中T调节细胞量比的影响

本研究通过Transwell细胞隔离培养体系探讨骨髓源间充质干细胞（MSC）对脐血（CB）来源细胞因子诱导杀伤细胞（CIK）／自然杀伤细胞（NK）CD69的表达以及对培养体系中CD4^＋CD25^＋T调节（Treg）细胞量比的影响。利用聚碳酯膜孔径0．4μm的Transwell隔离细胞培养系统将实验组分为隔离培养（Transwell）组和直接混合（mixture）培养组;将MSC和CIK／NK细胞按1：20、1：50和1：100的比例分别在Transwell组和mixture组中进行隔离和直接混合培养,每组6个重复孔;培养48小时后通过流式细胞术检测各纽CIK／NK细胞上CD69的表达以及培养体系中CD4^＋CD25^＋细胞量比的变化。结果显示：加入MSC的实验各组CB-CIK细胞和NK细胞上表达的CD69比例均显著低于对照组（P值均〈0．001）．Transwell组中的CIK和NK细胞上表达的CD69,在MSC的高浓度组（1：20组）均显著低于低浓度组（1：50组和1：100组）,其中CIK细胞组间的P值分别为0．046、0．020;NK细胞组间的P值均为0．000。mixture组中不同比例组问CIK细胞上表达的CD69无显著性差异,而NK细胞上CD69的表达在MSC的高浓度组（1：20组）均显著低于低浓度组（1：50组和1：100组）。加入MSC的CB—CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋细胞的量比不论在Transwell还是mixture组中均显著高于对照组（P值均〈0．01）;在Transwell组中．CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋细胞的量比在1：20组、1：50组均显著高于1：100组;在mixture各组中,CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋T调节细胞的量比均有显著性差异。MSC的高浓度组（1：20组）,CIK／NK细胞体系中的CD4^＋CD25^＋细胞量比在mixture组显著高于Transwell组;而在MSC的低浓度组（1：50纽和1：100组）,2纽体系中的C04^＋CD25^＋细胞量比无显著性差异。结论：MSC能以直接接触或间接作用的方式抑制异基因CIK／NK细胞的活化,这可能与MSC能上调培养体系中的CD4^＋CD25^＋Treg细胞量比有关,且这种作用与MSC的数量呈浓度依赖关系。     

大鼠皮肤的冷冻干燥保存

背景:细胞干燥保存的研究报道较多,组织器官是否适用于干燥保存,尚缺乏证据.目的:用海藻糖作为干燥保护剂,优化海藻糖载入大鼠皮肤的条件,探索皮肤干燥保存的可行性.设计、时间及地点:观察性实验,于2007-11/2008-11在西北大学生命科学学院组织工程实验室完成.材料:体质量150 g左右成年SD大鼠.海藻糖由Sigma公司提供.方法:通过控制海藻糖浓度(50,300,500,800,1 000 mmol/L)、负载时间(0.5,4,7,9 h)和温度[4℃、4～37℃(相转变)和37℃],优化海藻糖导入大鼠皮肤的条件.将负载海藻糖的皮肤置于含100 g/L二甲基亚砜的DMEM冷冻液中孵育,程序冷冻仪以1℃/min的速率降温至-80℃后移入冷冻干燥机中进行冻干.将冻干皮肤水化复苏后分别用双醋酸羧基荧光素(CFDA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)检测皮肤活性,并以新鲜和甲醛固定皮肤的吸光度值作为阳性和阴性对照.以苏木精-伊红染色和观察皮肤组织结构,并进行自体移植.主要观察指标:海藻糖在不同加载浓度、孵育温度和时间载入大鼠皮肤的情况.冻干皮肤水化后的形态学、组织学变化及其自体移植后存活情况.结果:海藻糖浓度小于800 mmol/L,皮肤的海藻糖载入量随海藻糖浓度的升高而明显增(P<0.05),浓度大于800 mmol/L,海藻糖载入量差异不显著.孵育温度为37℃组和相转变组皮肤海藻糖载入量明显高于4℃组(P<0.05),相转变组与37℃组差异无统计学意义.皮肤孵育4,7,9 h的海藻糖载入量明显高于孵育0.5 h的载入量(P<0.05),孵育时间为4,7,9 h之间的海藻糖载入量差异不显著,但孵育7 h后皮肤的海藻糖载入量不再增加.实验以海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h为优化的负载条件处理大鼠皮肤.冻干皮肤玻璃化状态良好,呈半透明状.水化后能够恢复到新鲜皮肤的大小和色泽,组织结构和细胞形态与新鲜皮肤组织无差别.冷冻干燥皮肤的活性明显高于甲醛固定的大鼠皮肤(P<0.05).冻干保存的皮肤水化后移植回自体大鼠,可存活长达13 d.结论:海藻糖可作为干燥保护剂进行大鼠皮肤冷冻干燥保存,海藻糖浓度为800 mmol/L,孵育温度为37℃,孵育时间为7 h是海藻糖载入大鼠皮肤的最佳条件.     

骨髓间充质干细胞诱导分化为心肌细胞及其内向整流钾电流特征

[目的]体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌细胞并探讨其内向整流钾电流(Ik1)特征.[方法]采用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓MSCs,在第3代细胞以5-氮杂胞苷进行诱导,用免疫细胞化学染色和RT-PCR方法鉴定诱导细胞,并采用全细胞膜片钳技术检测Ik1表达.[结果]诱导后细胞体积较诱导前增大,呈长梭形.14 d后细胞之间出现连接,排列方向渐趋一致.免疫细胞化学染色显示Desmin、αt-sarcomeric actin和心肌特异性cTnI呈阳性反应,RT-PCR结果表明诱导细胞有心肌β肌球蛋白重链表达.诱导细胞Ik1表达呈明显的不均一性,部分细胞Ik1与正常心室肌细胞相似,但Ik1电流密度总体上低于正常心室肌细胞.[结论]5-氮杂胞苷能在体外诱导MSCs向心肌细胞分化;诱导细胞Ik1表达不均一性提示可能有致心律失常潜能.     

哮喘患儿的外周血淋巴细胞CD40/CD40L的表达及其与Tc1和Tc2的关系

 【目的】研究发作期哮喘患儿的外周血CD40、CD40L的表达率及其与Tc1和Tc2的关系。【方法】应用流式细胞术检测30例哮喘患儿和20例正常对照儿童的外周血淋巴细胞CD40、CD40L的表达率和Tc1、Tc2的细胞数。【结果】哮喘患儿和正常对照组的外周血淋巴细胞CD40表达率分别为21.59±7.61和15.82±4.44(t=3.376,P<0.001);CD40L表达率分别为0.20±0.11和0.33±0.12(t=-2.747,P<0.05);Tc1细胞数分别为9.06±3.80和7.28±3.01(t=0.582,P>0.05);Tc2细胞数分别为7.64±3.67和3.02±1.38(t=3.981,P<0.001)。CD40和CD40L表达率与Tc1、Tc2数量无显著的相关性(r分别为-0.004和0.231、-0.280和0.186,P>0.05)。【结论】发作期哮喘患儿存在明显的CD40/CD40L、Tc1/Tc2的异常,这可能与哮喘的发生有重要的关联。     

热休克蛋白对树突状细胞成熟的影响研究

目的:探讨热休克蛋白(HSP)对树突状细胞(DCs)成熟的影响,同时对其形态学动态变化进行研究。方法:从肝癌组织中提取HSP(gp96 )抗原肽复合物;肝癌细胞进行热休克处理诱导其表面表达HSP,再用DiI荧光标记;将两种HSP与DCs混合培养,动态观察DCs捕获抗原和成熟过程中的形态学变化。流式细胞仪检测不同情况下热休克蛋白对DCs成熟表型的影响。结果:使用DiI标记的方法良好地显示了DCs摄取抗原的形态学变化;DCs通过直接接触、包绕、形成囊泡和伸出伪足且末端形成囊泡4种方式摄取抗原;热休克蛋白可促进DCs成熟表型的表达。结论:DiI是适合DCs形态学研究的良好的荧光标记物;DCs捕获抗原有4种不同方式;不同热休克蛋白均可促进DCs成熟,但提取的热休克蛋白作用更显著。     

流式细胞仪快速优化大鼠原代培养肝细胞基因转染

【目的】用流式细胞仪(FCM)快速检测外源性血管内皮生长因子基因(VEGF基因)在大鼠原代培养肝细胞转染表达，根据结果优化其转染表达条件。【方法】以加强型黄色荧光素蛋白(EYFP)为标记，用FCM快速检测重组质粒pIRES-EYFP／VEGF121在大鼠原代培养肝细胞中转染表达，根据结果优化pIRES-EYFP／VEGF121转染表达条件。【结果】pIRES-EYFP／VEGF121得以成功构建，并转染大鼠原代培养肝细胞；优化的转染表达条件：在细胞数密度O．1xl0^6／mL，质粒孵育时间30min，质粒与脂质体混合物孵育时间15min，质粒与脂质体比例为1：1O，转染时间2h，NAIR-1作转染培养液时，转染效率达17．5％。【结论】以EYFP为标记，FCM可简便快捷地检测并优化外源性VEGF基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达，可为研究VEGF基因修饰大鼠原代培养肝细胞移植和肝基因治疗打基础。