SV40LTag基因诱导永生化大鼠肝星状细胞系的建立及鉴定

目的： 建立长期传代、形态和生物学特性稳定的永生化HSC。方法： 采用Pronase E、Ⅳ型胶原酶原位灌流消化及Nycodenz密度梯度离心分离大鼠原代肝星状细胞（HSC）,并进行免疫组化SABC法鉴定和培养。用Effectene Transfection Reagent方法将携带SV40LTag基因的质粒PSV3neo（该质粒由意大利学者Giovanni Gaudino PhD惠赠）转染第1代HSC，以G418筛选直至获得阳性克隆细胞，经体外长期培养和传代后，以PCR方法检测其SV40LT抗原mRNA的表达，观察细胞形态学，绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖能力，用免疫组化SABC法对α-SMA、SV40LTag、Ⅰ、Ⅲ型胶原（collagenⅠ、collagenⅢ）、desmin、转化生长因子-β₁（TGF-β₁）、血小板衍生的生长因子受体β型（PDGFRβ）进行免疫细胞化学检测，用β-actin做半定量RT-PCR检测I型胶原的表达，对其生物学特性进行研究。结果： 本研究通过使用质粒 PSV3neo转染正常大鼠HSC，经20 d抗性筛选，获得G418阳性克隆细胞，长期传代后细胞形态和结构保持完好，SV40LTag mRNA的表达检测和免疫组化染色结果阳性，经扩大筛选培养，该HSC细胞系目前已传了50代,保持着星形外观的HSC形态学特征，生长曲线显示转染阳性细胞倍增速度快，MTT法测定570 nm波长下A值显著高于对照组（P<0.01）。半定量RT-PCR法检测collagenⅠmRNA的表达明显高于对照组（P<0.01）。免疫组化染色显示能表达α-SMA、 collagenⅠ、collagenⅢ、desmin、TGF-β₁、PDGFRβ。结论： 利用SV40LTag基因序列诱导建立了永生化大鼠HSC系，新建HSC系在体外可长期传代，倍增速度快，其形态和生物学特性与原代HSC形态相似。     

拉米夫定长期治疗复发病例中HBV YMDD基序的变化

拉米夫定为核苷类似物 ,对乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)的复制有抑制作用 ,近年应用于慢性乙型肝炎和肝移植术后防治ＨＢＶ再感染。有报道在长期接受拉米夫定治疗的部分患者中出现耐药 ,耐药的产生与病毒多聚酶编码区的变异有关。我们检测了 4例拉米夫定治疗复发患者的ＨＢＶＤＮＡ ,了解变异的发生情况 ,报道如下。材料与方法一、研究对象4例患者为 1997年始在我院接受拉米夫定治疗的慢性ＨＢＶ感染者 ,均为男性 ,平均年龄 2 4岁 (中位数 )。治疗前ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗 ＨＢｃ和血清ＨＢＶＤＮＡ均为阳性 ,其他肝炎病毒标志为阴性 ,血清…     

慢性乙肝患者停用拉米夫定后出现肝功能衰竭的危险因素

[目的]研究慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,慢性乙型肝炎)患者停用拉米夫定后出现肝功能衰竭的危险因素.[方法]停用拉米夫定治疗后复发的慢性乙型肝炎患者71例纳入研究,记录治疗前病程、诊断、拉米夫定疗程,用拉米夫定前、停用时和复发后的生化指标、免疫学指标、病毒学指标及YMDD变异、前C区变异,按复发后的诊断分为肝功能衰竭组和慢性乙型肝炎组进行比较.[结果]肝功能衰竭组患者中位年龄38.0岁,大于慢性乙型肝炎组31.5岁(Z=3.49,P＜0.01);年龄(Wald=10.13,P＜0.05)和拉米夫定治疗前诊断为失代偿性肝硬化(Wald=7.61,P＜0.05)都是停药反跳后出现肝功能衰竭的独立危险因素.肝功能衰竭组服拉米夫定前总胆红素异常患者20.0%(x=16.50,P＜0.01),停拉米夫定后未随访者86.7%(x2=17.57,P＜0.01),停拉米夫定时未出现Anti-HBe阳转者85.2%(x2=8.04,P＜0.01),复发时HBV DNA载量3.0×108±4.8×108(Z=4.46,P＜0.01),前C区联合YMDD变异者56.0%(x=11.69,P＜0.01),均高于慢性乙型肝炎组.[结论]拉米夫定治疗前年龄大、总胆红素异常、诊断为失代偿性肝硬化,停药时未发生Anti-HBe阳转,停药后无随访,复发时HBV DNA载量超过1×108拷贝/mL、出现前C区联合YMDD变异可能是停拉米夫定后出现肝功能衰竭的危险因素.     

CC类趋化因子配体5水平与慢性乙型病毒性肝炎患者肝脏炎症程度的关系——附64例检测分析

目的:探讨慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)患者肝组织CC类趋化因子配体5(CC chemokine ligand 5,CCL5)水平与肝脏炎症程度的关系.方法:64例慢乙肝患者和10名正常人的肝组织标本按照炎症(G)分级标准分为G0～G4,用免疫组织化学染色定性及图像分析系统定量检测肝组织趋化因子CCL5的表达情况,并用Spearman等级相关分析进行相关性分析.结果:10名正常人的肝组织炎症分级均为G0,慢乙肝组则分别为G115例、G220例、G317例、G412例.慢乙肝组肝组织CCL5的表达明显高于正常对照组(P=0.000);G0～G4者肝组织CCL5的表达阳性单位(positive unit,PU)分别为(3.7±1.5),(15.0±5.7),(21.6±5.9),(30.3±8.2)和(40.9±12.3),慢乙肝患者的肝组织CCL5的表达程度与肝组织炎症分级之间呈显著的正相关(r=0.865,P=0.000).结论:CCL5在慢乙肝肝脏炎症的发生中具有重要作用.     

华南地区HGV的流行状况和同源性分析

目的了解华南地区庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）的流行状况及ＨＧＶ不同株和不同基因区的同源性。方法采用逆转录聚合酶链反应技术（ＲＴ－ＰＣＲ）检测来自广东、香港、云南的不同人群血清标本共１９９１份。对其中２０份的５端非编码区（５ＵＴＲ）２３８ｂｐ和３份非结构蛋白５区（ＮＳ５）６２１ｂｐ进行了序列测定和同源性分析。结果一般人群ＨＧＶＲＮＡ阳性率为（０．７３～１．３４）％,献血员（２．５２～２．９０）％,静脉吸毒者１７．８６％,血液透析患者１４．１３％,接受骨髓移植者４１．６７％,在非甲～戊型肝炎病人为２５．３０％,肝细胞癌１４．４８％,乙型肝炎７．２２％,丙型肝炎（８．３３～１６．１３）％。不同株５ＵＴＲ同源性介乎（９０．４０～１００）％;不同株ＮＳ５区核苷酸同源性（９３．３０～９４．００）％,氨基酸为（９７～９９．２）％。结论接受骨髓移植、血液透析、静脉吸毒者,乙型、丙型、非甲～戊型肝炎病人及肝细胞癌患者是ＨＧＶ的高感染人群。不同ＨＧＶ株存在一定的地区性差异;同一地区不同人群的ＨＧＶ株变异不明显;序列中存在高度保守区及较大变异区     

广东省HIV-1流行株的基因亚型分析

目的　了解广东省人免疫缺陷病毒 - 1(HIV - 1)感染毒株的亚型分布情况。方法　用巢式聚合酶链反应 (nPCR)技术 ,对 1998年初至 2 0 0 2年 2月间广东省内 13例HIV - 1感染者血标本进行膜蛋白基因 (env)部分片段扩增 ,将扩增产物克隆至T载体上并进行序列分析。结果　在 11例扩增成功的血标本中 ,B亚型 6例 ,其中 3例来自献血人员 ,1例为性乱人员和 2例为吸毒人员 ;E亚型 5例 ,其中 3例为性乱人员 ,1例来自吸毒人员 ,1例来自献血人员。 5例E亚型基因离散率为 ( 6 6± 3 8) % ;6例B亚型基因基因离散率为 ( 7 6± 1 9) % ,与来自泰国和国内的B亚型代表株最接近。结论　广东省至少有HIV - 1B和E亚型毒株流行 ,且分布广泛 ,来源复杂     

HGV NS5A区部分基因的克隆及表达

目的：构建含HGV NS5A区基因的原核表达载体。方法：采用PCR方法从重组了HGV 6672-7292区段基因的pUC19中扩增出HGV 6864-7277nt片段，定向克隆入pGEMEX1质粒，再经SacI、HindⅢ酶切亚克隆入高效表达载体pRSETA.结果：重组pRSETA经序列测定证实插入基因为目的的基因，符合表达框架，经IPTG诱导，在BI21（DE3)菌株中表达连接6个组氨酸的HGV NS5A融合蛋白。Western blotting显示在Marker约25k处可见明显的蛋白带，与预期结果一致。结论：成功构建了重组HGV NS5A区基因表达载体，在BI21(DE3)中能有效表达。     

BMP-7在SD大鼠肝脏的表达

目的：通过对正常SD大鼠及肝功能衰竭模型、肝纤维化模型肝组织中骨形态发生蛋白7（bone morphogeneticrotein-7，BMP-7）表达的分析，初步探讨BMP-7在肝脏炎症和肝细胞再生过程中可能发挥的作用。方法：分别采用腹腔注射四氯化碳或D-氨基半乳糖的方法构建SD大鼠肝纤维化模型及肝功能衰竭模型。采用RT—PCR方法研究BMP-7mRNA的表达，并对4例正常SD大鼠、11例肝功能衰竭模型、3例肝纤维化模型中BMP-7mRNA的表达进行实时荧光定量RT—PCR分析。结果：BMP-7在正常SD大鼠肝脏有表达，BMP-7／β—actin在正常大鼠肝组织（0．449±0．154）高于肝功能衰竭模型肝组织（0．044±0，024），低于肝纤维化模型肝组织（3．174±2．525），与后者的差异无显著性。结论：BMP-7在正常SD大鼠肝脏有表达，在肝纤维化模型表达增加，在肝功能衰竭模型表达减少。     

重组人BMP-7真核表达质粒的构建及转染软骨细胞后的表达

[目的]构建重组人骨形成蛋白-7（rhBMP-7）基因真核表达质粒，转染兔关节软骨细胞，探讨外源性人rhBMP-7基因在转染软骨细胞中的表达情况及对细胞生物学性状的影响。[方法]采用PCR技术扩增rhBMP-7基因，将其插入真核表达载体pcDNA3．1中，体外分离培养兔关节软骨细胞，然后用构建的rhBMP-7质粒转染软骨细胞，经G418筛选、免疫组化染色和逆转录PCR检测其表达，同时检测表达产物对维持软骨细胞表型的作用。[结果]经过PCR及酶切鉴定证实获得了BMP-7真核表达质粒pcDNA3．1-rhBMP-7，通过免疫组化染色和逆转录PCR鉴定证实rhBMP-7在转染后的软骨细胞中得到了表达，其表达产物促进软骨细胞表型的维持。[结论]外源性rhBMP-7基因转染软骨细胞可以获得高效表达，并具有一定的维持软骨细胞表型的作用，为软骨组织工程的研究提供了改良的种子细胞。