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目的: 建立长期传代、形态和生物学特性稳定的永生化HSC。方法: 采用Pronase E、Ⅳ型胶原酶原位灌流消化及Nycodenz密度梯度离心分离大鼠原代肝星状细胞(HSC),并进行免疫组化SABC法鉴定和培养。用Effectene Transfection Reagent方法将携带SV40LTag基因的质粒PSV3neo(该质粒由意大利学者Giovanni Gaudino PhD惠赠)转染第1代HSC,以G418筛选直至获得阳性克隆细胞,经体外长期培养和传代后,以PCR方法检测其SV40LT抗原mRNA的表达,观察细胞形态学,绘制细胞生长曲线,MTT法检测细胞增殖能力,用免疫组化SABC法对α-SMA、SV40LTag、Ⅰ、Ⅲ型胶原(collagenⅠ、collagenⅢ)、desmin、转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生的生长因子受体β型(PDGFRβ)进行免疫细胞化学检测,用β-actin做半定量RT-PCR检测I型胶原的表达,对其生物学特性进行研究。结果: 本研究通过使用质粒 PSV3neo转染正常大鼠HSC,经20 d抗性筛选,获得G418阳性克隆细胞,长期传代后细胞形态和结构保持完好,SV40LTag mRNA的表达检测和免疫组化染色结果阳性,经扩大筛选培养,该HSC细胞系目前已传了50代,保持着星形外观的HSC形态学特征,生长曲线显示转染阳性细胞倍增速度快,MTT法测定570 nm波长下A值显著高于对照组(P<0.01)。半定量RT-PCR法检测collagenⅠmRNA的表达明显高于对照组(P<0.01)。免疫组化染色显示能表达α-SMA、 collagenⅠ、collagenⅢ、desmin、TGF-β1、PDGFRβ。结论: 利用SV40LTag基因序列诱导建立了永生化大鼠HSC系,新建HSC系在体外可长期传代,倍增速度快,其形态和生物学特性与原代HSC形态相似。 相似文献
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拉米夫定长期治疗复发病例中HBV YMDD基序的变化 总被引:6,自引:0,他引:6
拉米夫定为核苷类似物 ,对乙型肝炎病毒 (HBV)的复制有抑制作用 ,近年应用于慢性乙型肝炎和肝移植术后防治HBV再感染。有报道在长期接受拉米夫定治疗的部分患者中出现耐药 ,耐药的产生与病毒多聚酶编码区的变异有关。我们检测了 4例拉米夫定治疗复发患者的HBVDNA ,了解变异的发生情况 ,报道如下。材料与方法一、研究对象4例患者为 1997年始在我院接受拉米夫定治疗的慢性HBV感染者 ,均为男性 ,平均年龄 2 4岁 (中位数 )。治疗前HBsAg、HBeAg、抗 HBc和血清HBVDNA均为阳性 ,其他肝炎病毒标志为阴性 ,血清… 相似文献
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慢性乙肝患者停用拉米夫定后出现肝功能衰竭的危险因素 总被引:4,自引:2,他引:2
[目的]研究慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,慢性乙型肝炎)患者停用拉米夫定后出现肝功能衰竭的危险因素.[方法]停用拉米夫定治疗后复发的慢性乙型肝炎患者71例纳入研究,记录治疗前病程、诊断、拉米夫定疗程,用拉米夫定前、停用时和复发后的生化指标、免疫学指标、病毒学指标及YMDD变异、前C区变异,按复发后的诊断分为肝功能衰竭组和慢性乙型肝炎组进行比较.[结果]肝功能衰竭组患者中位年龄38.0岁,大于慢性乙型肝炎组31.5岁(Z=3.49,P<0.01);年龄(Wald=10.13,P<0.05)和拉米夫定治疗前诊断为失代偿性肝硬化(Wald=7.61,P<0.05)都是停药反跳后出现肝功能衰竭的独立危险因素.肝功能衰竭组服拉米夫定前总胆红素异常患者20.0%(x=16.50,P<0.01),停拉米夫定后未随访者86.7%(x2=17.57,P<0.01),停拉米夫定时未出现Anti-HBe阳转者85.2%(x2=8.04,P<0.01),复发时HBV DNA载量3.0×108±4.8×108(Z=4.46,P<0.01),前C区联合YMDD变异者56.0%(x=11.69,P<0.01),均高于慢性乙型肝炎组.[结论]拉米夫定治疗前年龄大、总胆红素异常、诊断为失代偿性肝硬化,停药时未发生Anti-HBe阳转,停药后无随访,复发时HBV DNA载量超过1×108拷贝/mL、出现前C区联合YMDD变异可能是停拉米夫定后出现肝功能衰竭的危险因素. 相似文献
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目的:探讨慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)患者肝组织CC类趋化因子配体5(CC chemokine ligand 5,CCL5)水平与肝脏炎症程度的关系.方法:64例慢乙肝患者和10名正常人的肝组织标本按照炎症(G)分级标准分为G0~G4,用免疫组织化学染色定性及图像分析系统定量检测肝组织趋化因子CCL5的表达情况,并用Spearman等级相关分析进行相关性分析.结果:10名正常人的肝组织炎症分级均为G0,慢乙肝组则分别为G115例、G220例、G317例、G412例.慢乙肝组肝组织CCL5的表达明显高于正常对照组(P=0.000);G0~G4者肝组织CCL5的表达阳性单位(positive unit,PU)分别为(3.7±1.5),(15.0±5.7),(21.6±5.9),(30.3±8.2)和(40.9±12.3),慢乙肝患者的肝组织CCL5的表达程度与肝组织炎症分级之间呈显著的正相关(r=0.865,P=0.000).结论:CCL5在慢乙肝肝脏炎症的发生中具有重要作用. 相似文献
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华南地区HGV的流行状况和同源性分析 总被引:2,自引:0,他引:2
目的了解华南地区庚型肝炎病毒(HGV)的流行状况及HGV不同株和不同基因区的同源性。方法采用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测来自广东、香港、云南的不同人群血清标本共1991份。对其中20份的5端非编码区(5UTR)238bp和3份非结构蛋白5区(NS5)621bp进行了序列测定和同源性分析。结果一般人群HGVRNA阳性率为(0.73~1.34)%,献血员(2.52~2.90)%,静脉吸毒者17.86%,血液透析患者14.13%,接受骨髓移植者41.67%,在非甲~戊型肝炎病人为25.30%,肝细胞癌14.48%,乙型肝炎7.22%,丙型肝炎(8.33~16.13)%。不同株5UTR同源性介乎(90.40~100)%;不同株NS5区核苷酸同源性(93.30~94.00)%,氨基酸为(97~99.2)%。结论接受骨髓移植、血液透析、静脉吸毒者,乙型、丙型、非甲~戊型肝炎病人及肝细胞癌患者是HGV的高感染人群。不同HGV株存在一定的地区性差异;同一地区不同人群的HGV株变异不明显;序列中存在高度保守区及较大变异区 相似文献
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肝纤维化基因治疗的研究进展 总被引:2,自引:0,他引:2
马会慧 《国外医学:内科学分册》2000,27(9):386-389,401
肝纤维化仍缺少有效的治疗措施。本文将围绕近年来对肝纤维化形成机制的认识,对采用基因治疗防治肝纤维化的相关探索性研究作一综述。 相似文献
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目的 了解广东省人免疫缺陷病毒 - 1(HIV - 1)感染毒株的亚型分布情况。方法 用巢式聚合酶链反应 (nPCR)技术 ,对 1998年初至 2 0 0 2年 2月间广东省内 13例HIV - 1感染者血标本进行膜蛋白基因 (env)部分片段扩增 ,将扩增产物克隆至T载体上并进行序列分析。结果 在 11例扩增成功的血标本中 ,B亚型 6例 ,其中 3例来自献血人员 ,1例为性乱人员和 2例为吸毒人员 ;E亚型 5例 ,其中 3例为性乱人员 ,1例来自吸毒人员 ,1例来自献血人员。 5例E亚型基因离散率为 ( 6 6± 3 8) % ;6例B亚型基因基因离散率为 ( 7 6± 1 9) % ,与来自泰国和国内的B亚型代表株最接近。结论 广东省至少有HIV - 1B和E亚型毒株流行 ,且分布广泛 ,来源复杂 相似文献
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目的:构建含HGV NS5A区基因的原核表达载体。方法:采用PCR方法从重组了HGV 6672-7292区段基因的pUC19中扩增出HGV 6864-7277nt片段,定向克隆入pGEMEX1质粒,再经SacI、HindⅢ酶切亚克隆入高效表达载体pRSETA.结果:重组pRSETA经序列测定证实插入基因为目的的基因,符合表达框架,经IPTG诱导,在BI21(DE3)菌株中表达连接6个组氨酸的HGV NS5A融合蛋白。Western blotting显示在Marker约25k处可见明显的蛋白带,与预期结果一致。结论:成功构建了重组HGV NS5A区基因表达载体,在BI21(DE3)中能有效表达。 相似文献
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目的:通过对正常SD大鼠及肝功能衰竭模型、肝纤维化模型肝组织中骨形态发生蛋白7(bone morphogeneticrotein-7,BMP-7)表达的分析,初步探讨BMP-7在肝脏炎症和肝细胞再生过程中可能发挥的作用。方法:分别采用腹腔注射四氯化碳或D-氨基半乳糖的方法构建SD大鼠肝纤维化模型及肝功能衰竭模型。采用RT—PCR方法研究BMP-7mRNA的表达,并对4例正常SD大鼠、11例肝功能衰竭模型、3例肝纤维化模型中BMP-7mRNA的表达进行实时荧光定量RT—PCR分析。结果:BMP-7在正常SD大鼠肝脏有表达,BMP-7/β—actin在正常大鼠肝组织(0.449±0.154)高于肝功能衰竭模型肝组织(0.044±0,024),低于肝纤维化模型肝组织(3.174±2.525),与后者的差异无显著性。结论:BMP-7在正常SD大鼠肝脏有表达,在肝纤维化模型表达增加,在肝功能衰竭模型表达减少。 相似文献