SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒。并通过Lipofectamine 2000将它们转染到HEK293细胞,RT-PCR和Western-blot鉴定重组质粒在真核细胞中的转录和表达。以构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建了重组真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中获得表达。免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1∶3 200。pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3。脾脏T淋巴细胞亚群分析示pVAC-S1和pVAC-S2两免疫组小鼠CD3+和CD8+T细胞明显升高。结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。     

弓形虫 SAG1基因的表达及其诱导的细胞免疫应答

目的分析弓形虫 SAG1基因真核表达质粒的体外表达及其诱导小鼠的细胞免疫应答.方法重组表达质粒 pVAX1-SAG1瞬时转染 vero细胞, Western blot法检测在细胞中的表达.将重组真核表达质粒 pVAX1-SAG1及空质粒 pVAX1于 0、 4周分别经肌注免疫 BALB/c小鼠;第 8周杀鼠,取脾,分离淋巴细胞,分别经 ConA和抗原刺激,用 MTT法测定免疫鼠脾脏 T淋巴细胞转化率 ;使用直接免疫荧光法 ,用流式细胞仪对 CD4+、 CD8+ T细胞亚群进行测定;两组小鼠经弓形虫速殖子攻击感染,计算存活期.结果 Western blot法分析转染细胞,发现存在弓形虫感染血清识别的 26 000u的特异带,与理论值相符 ;抗原刺激小鼠脾 T淋巴细胞发生增殖反应 , 免疫组与空质粒对照组间差异有显著性 (P< 0.05),但 ConA刺激小鼠后,两组间差异无显著性 (P >0.05); T细胞亚群 CD4+、 CD8+动态分析 ,CD4+、 CD8+ T细胞数量均升高,免疫组与空质粒对照组差异均有显著性 (P1< 0.05, P2< 0.05).弓形虫攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较空质粒对照组延长.结论 真核表达质粒 pVAX1-SAG1在 vero细胞中获得表达 ,且能诱导 BALB/c小鼠产生细胞免疫应答.     

Expression and Purification of SARS Coronavirus Membrane Protein

To construct a recombinant plasmid Pet23a-M, the gene encoding severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus membrane protein was amplified by RT-PCR and cloned into the expression plasmid Pet23a. Results of restriction endonuclease analysis, PCR detection and DNA sequencing analysis revealed that the cloned DNA sequence was the same as that reported. The recombinants were transformed into Escherichia coli (E. Coli) BL21 (DE3) and induced by Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). The expression of 27 kD (1 kD=0. 992 1 ku) protein was detected by SDS-PAGE and pured by metal chelated chromatography. Results of Western-blot showed that this expressed protein could react with antibodies in sera of SARS patients during convalescence. This provided the basis for the further study on SARS virus vaccine and diagnostic agents.     

几种SARS DNA疫苗对BALB/c小鼠重要器官影响的组织病理学研究

目的 用组织病理学方法观察几种SARSDNA疫苗对BALB／c小鼠重要器官的影响，为研制安全有效的SARSDNA疫苗奠定基础。方法 用RT-PCR的方法从SARS冠状病毒（SARS-CoV）基因组中扩增出M片段、E片段、N片段和S基因的两个主要片段S1，S2，然后将这些基因片段分别亚克隆至pVAC真核表达载体，制备出几种SARSDNA疫苗pVAC-S1、pVAC-S2、pVAC-M、pVAC-E、pVAC-N。用这些疫苗分别或联合免疫BALB／c小鼠后，取小鼠重要器官心、肝、脾、肺、肾，观察其组织病理学改变。结果 鼠心、脾和肾未见明显的组织病理学异常，但部分小鼠的肝和肺表现出下列病理变化：肝：出现片状肝细胞染色加深和肝细胞核固缩等凋亡早期改变，部分还可见到肝细胞水变性和肝窦变窄甚至消失等病变。肺：肺泡隔增厚，肺泡轮廓消失，或肺组织淤血水肿，甚至出现支气管肺炎改变。同时，在pVAC空质粒对照组也可见个别小鼠出现上述肝、肺病变。结论 由于对肝、肺产生组织病理学异常改变，制备高效、安全的SARS DNA疫苗还有待进一步研究和完善，载体的选择和质粒的用量也是必须加以考虑的问题。     

间日疟原虫MSP1C端基因亚克隆及在肠埃希菌中的融合表达

目的　在大肠埃希菌中融合表达间日疟原虫MSP1C端编码基因 ,以获得能作为检测抗原的重组蛋白GST PvMSP1C。　方法　以限制性内切酶BamHⅠ和SalⅠ双酶切质粒pMD/PvMSP1C ,获得间日疟原虫MSP1C端编码基因片段 ,柱纯化后 ,插入表达质粒载体的多克隆位点 ,构建重组体 pGEX 4T 2 /PvMSP1C ,并转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,阳性克隆以限制性酶切分析鉴定后 ,以IPTG进行诱导表达 ,表达产物以SDS PAGE电泳与免疫印迹分析。　结果　双酶切质粒pMD/PvMSP1C ,获得 1119bp的PvMSP1C编码基因片段 ,与预期片段大小相符 ;所构建的 pGEX 4T 2 /PvMSP1C重组体阳性克隆经双酶切鉴定与预期结果一致 ;SDS PAGE电泳显示 ,GST PvMSP1C融合表达蛋白的大小约 63ku ,且能够分别被GST抗体与间日疟患者的血清所识别。　结论　成功亚克隆并构建了间日疟原虫MSP1C端编码基因 pGEX 4T 2 /PvMSP1C表达质粒 ,诱导表达了GST PvMSP1C融合蛋白 ,表达蛋白具有一定免疫活性。     

弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体构建及在Vero细胞中的表达

目的　构建弓形虫表面抗原SAG2的DNA疫苗载体 ,并在Vero细胞中表达。　方法　设计 1对引物 ,从弓形虫RH株速殖子基因组DNA中扩增SAG2全长编码基因 ,构建 pVAX1 SAG2真核表达重组质粒。以限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅠ进行双酶切、PCR鉴定 ,纯化后进行测序鉴定。脂质体介导法瞬时转染Vero细胞 ,同时以 pVAX1为对照 ,48h后收集细胞 ,Western blot鉴定。　结果　从弓形虫RH株DNA中扩增出了 5 77bp的SAG2基因 ,构建了真核表达载体 pVAX1 SAG2 ,在质脂体介导下转染Vero细胞 ,质粒DNA成功的转染到细胞中。通过Westen blot分析 ,细胞裂解液样品有 1条可被弓形虫免疫血清所识别的约 17ku大小的条带 ,与预计大小一致。　结论　真核表达载体pVAX1 SAG2在Vero细胞中有一定表达 ,且有一定的活性。     

基于多叶准直器日志文件的鼻咽癌调强放疗的累积剂量验证

目的 利用多叶准直器(MLC)日志文件验证鼻咽癌患者动态调强放疗的累积剂量,分析MLC叶片位置偏差与剂量学关系。方法 跟踪记录5例鼻咽癌患者的28个分次动态调强放疗,共计1 400个日志文件。通过Argus软件解析和提取MLC叶片的实际位置信息,并与MLC叶片的计划位置信息比较,计算每个MLC叶片的位置偏差和所有患者的整体平均叶片位置偏差。将MLC文件导入治疗计划系统(TPS)进行剂量重建计算,分别比较和分析每个病例重建计划和原计划的28次累积剂量差异及单次相对剂量差异。结果 单个叶片位置偏差<0.50 mm约占90%,0.50~1.00 mm之间的占4%~11%,1.00~1.50 mm约占8‰,整体平均叶片位置偏差为0.16 mm。与原始计划累积剂量相比,重建计划的叶片位置偏差导致靶区累积相对剂量差异<±0.1%,危及器官的累积相对剂量差异<±0.6%,差异均无统计学意义(P>0.05);而与原始计划的单次剂量相比,重建计划的靶区和脑干、脊髓和右眼晶状体单次剂量差异有统计学意义(z=-2.02~4.61和4.46、-4.51、2.07, P<0.05)。结论 基于动态调强日志文件的分次累积剂量验证,一定程度上减小了单次MLC叶片位置偏差对剂量的影响,验证结果可更加精确地反映患者的实际受照剂量。     

基于深度学习方法预测IMRT计划射野的γ通过率

目的:建立卷积神经网络（CNN）模型预测IMRT计划射野的γ通过率（GPR）。方法:从Eclipse治疗计划系统中选取48例脑胶质瘤患者的IMRT计划,共计260个照射野,制作每个计划基于电子射野影像系统测量的验证计划,并在Varian 23EX直线加速器上执行。利用portal dosimetry剂量测定软件包对计划剂量的计算值和电子射野影像系统实测值进行γ分析,得到射野在2%（global）/2 mm标准下的GPR。选取portal dosimetry系统计算的剂量分布图作为输入数据,并将数据集划分为训练集208个射野,验证集和测试集各26个射野。基于tensorflow框架建立CNN模型去学习射野的剂量分布图与GPR之间的相关性,并使用平均绝对误差对模型的预测效果进行评估。结果:在验证集和测试集上,96%样本的GPR预测误差都小于±3%,最大误差分别为3.09%和3.54%,平均绝对误差分别为0.99%和1.17%,模型预测和实际测量的GPR之间的皮尔逊相关性系数r分别为0.96和0.90。结论:深度学习CNN模型可以准确地预测脑胶质瘤患者IMRT计划射野的GPR,有助于物理师提前识别可能不能通过QA测量的计划,有效地促进临床放疗的QA工作。     

Glypican-3的真核表达及单克隆抗体的制备

目的:建立能够稳定表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)的细胞株,制备抗人GPC3的单克隆抗体(mAb)。方法:利用脂质体技术将GPC3重组质粒导入NIH3T3细胞,RT-PCR检测;以原核表达的GPC3片段为免疫原,经传统的杂交瘤技术获得稳定分泌抗免疫原的mAb细胞株,Westernblot和免疫荧光技术鉴定mAb特性。结果:成功获得一株稳定表达GPC3的细胞株,即NIH3T3-GPC3;建立5株能稳定分泌抗原核表达GPC3片段抗原的mAb细胞株。mAb细胞株的免疫球蛋白亚类是IgG2a。间接ELISA、West-ernblot和免疫荧光实验的结果证明,仅杂交瘤GPC34H11能分泌与完整的人GPC3蛋白结合的mAb。结论:建立稳定表达GPC3的鼠源模型细胞株;获得识别天然GPC3分子的mAb细胞株。