pLXSN—EGFP逆转录病毒载体的构建及体内外表达的研究

目的构建携带有绿色荧光蛋白（GFP）基因的逆转录病毒载体,观察该报告基因在动物体内外表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。方法以质粒pEGFP-C。为模板进行PCR反应,获得增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN获得重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后收集具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP作为报告基因在体内外的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。结果成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并在体内外稳定表达,对靶细胞及其所成肿瘤的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98％的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30．7％细胞表达GFP。结论该载体可在体内外成功表达,对靶细胞的生长无明显抑制,高表达GFP的靶细胞有一定形态上的变化：使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低。     

人皮肤源性间充质干细胞体外诱导向淋巴细胞分化的可能性

背景：研究发现真皮组织中存在间充质干细胞,存在自体移植的可能性。如能在一定条件下将皮肤来源的间充质干细胞诱导分化为淋巴细胞,则可解决许多免疫系统损伤疾病。 目的：探讨人皮肤源性间充质干细胞经体外诱导向淋巴细胞转分化的可能性。 方法：体外培养人皮肤源性间充质干细胞至第14代,流式细胞仪检测细胞表面标志的表达。诱导人皮肤源性间充质干细胞转分化的条件培养基由人淋巴细胞培养上清液和新鲜人皮肤源性间充质干细胞培养液以7∶3比例组成。倒置显微镜观察诱导后细胞形态学变化。流式细胞仪检测诱导后1~8 d细胞表面淋巴细胞标志的表达。流式细胞仪检测诱导后3,6,9 d人皮肤间充质干细胞自身标记表达的变化。 结果与结论：人皮肤源性间充质干细胞稳定表达自身特异性标志CD73,Vimentin等,不表达造血系统特异性标志CD34,CD45等,且低表达HLA-I,完全不表达HLA-DR。诱导3 d后,细胞体积明显增大,细胞增殖速度明显低于诱导前,细胞内和细胞间存在许多折光性强的囊胞样颗粒。除CD45淋巴细胞标志的表达无明显变化外,诱导后1~ 4 d人皮肤源性间充质干细胞CD3,CD19,CD16,CD4,CD8的表达率均随诱导时间的延长呈线性升高趋势,诱导后5~8 d处于平台期。诱导后3,6,9 d人皮肤源性间充质干细胞自身标记CD73,CD34,Vimentin,HLA-DR的表达无变化,HLA-I的表达率随诱导时间的延长逐渐上升。提示在体外人皮肤源性间充质干细胞可以被诱导向淋巴细胞转分化,具有参与免疫系统损伤修复的潜能。     

中药银杏叶对老年痴呆症小鼠学习记忆能力的影响

目的研究中药银杏叶与西药脑复康片对老年痴呆症小鼠学习记忆能力恢复效果的差异。方法 KM小鼠随机分为对照组、模型组、银杏叶组和脑复康组,各组20只。除对照组外,其余组采用腹腔注射D-半乳糖和灌胃AlCl3进行造模,连续60 d。银杏叶组和脑复康组自造模起给予相应的药物,连续60 d。试验结束后测定小鼠学习记忆能力,测定脑组织中乙酰胆碱酯酶活性、过氧化脂质(MDA)含量、超氧化岐化酶(SOD)活性、Na+、K+-ATPase、游离钙离子含量和进行脑神经元细胞计数。结果与模型组比较,银杏叶组动物潜伏期明显延长,错误次数降低(P0.05);银杏叶组动物脑组织SOD活性明显升高(P0.05),MDA含量、Ca+浓度含量、乙酰胆碱酯酶活性显著性降低(P0.05),与对照及脑复康组比较未见显著差异(P0.05);银杏叶组动物大脑海马锥体细胞数与模型组比较明显升高(P0.01),大脑皮质神经元细胞数与模型组比较无明显差异(P0.05)。结论中药银杏叶改善小鼠学习记忆障碍的作用与西药脑复康片相似。     

EB病毒基因片段的生物学活性——Ⅰ、基因片段转染、细胞转化与裸鼠成瘤的研究

过去有人提出EBV—DNA是通过病毒颗粒感染,或者是携带EBV基因的细胞与宿主细胞融合这两种途径之一,导致病毒基因转输入宿主细胞DNA。近年我们注意到:基因片段转染,是基因转移和导致细胞转化的一种重要形式。 本实验应用DNA介导的基因转移的钙沉淀改良法,在体外培养将EBV重复序列区的BamHl—W及其相邻片段转染宿主细胞(大鼠成纤维细胞,Rat—1),3周内出现转化灶,经半固体培养基进行转化选择,从而获得多株高效转化克隆,其中W_4和W_(10)通过裸鼠体内接种与鼠间移植,最后建立高移植成功率(94—100％)的可移植性裸鼠瘤(CH—1,CH—2)。 经SP6/T7RNA多聚酶诱导RNA探针、缺口翻译DNA探针和亚细胞定位的原位杂交探针综合应用,测知经EBV基因片转转染后多次传代的转化细胞(W_(10),W_4)和多次移植的裸鼠瘤(CH—1,CH—2)DNA中存在着EBV基因片段。另一方面,测知人类的鼻咽癌组织和Burkitt淋巴瘤细胞株以及绒猴的EBV转化细胞株中,恒定地整合着该基因片段。因此,EBV基因片段的活性及其在癌变过程中的作用,与癌基因激活等问题值得进一步研究。     

小鼠胚胎干细胞在六种培养体系的培养观察

目的　观察小鼠胚胎干细胞在六种培养体系中的生长情况。方法　小鼠胚胎干细胞 (ESD3细胞株 )在以下六种培养体系中培养 :1 .原代小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)有血清培养 ,2 .MEF无血清培养 ,3.SNL细胞有血清培养 ,4.LIF(白血病抑制因子 )有血清无饲养层培养 ,5.LIF无血清无饲养层培养 ,6.大鼠肝细胞 (BRL)条件培养基培养。经体外培养 1 0代后 ,观察其克隆形态 ,同时进行碱性磷酸酶检测并将ES细胞接种于裸小鼠皮下 ,观察ESD3的未分化状态和多潜能性。结果　六种培养体系培养的ESD3具有典型的ES细胞克隆形态 :巢状 (集落状 )隆起生长 ,边缘清楚 ,表面平滑 ,结构致密 ;AKP强阳性 ;裸小鼠体内形成了由多种组织构成的畸胎瘤。结论　六种培养体系均能支持ESD3生长 ,并能保持其未分化性和多潜能性 ,为ES细胞的应用研究奠定了良好的基础。     

tTS/rtTA系统下调目的基因基础表达的细胞模型研究

 [目的]构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型.[方法]通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素（1 mg/L）诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆.[结果]带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株（192：21）,其中克隆9的诱导倍数最高（256）,获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株.[结论]荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性.     

视黄酸联合视网膜细胞共培养对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的 探讨胚胎干细胞(ESC)在视黄酸联合视网膜细胞共培养诱导条件下的分化特征。方法 将ESC自液氮中复苏、培养，传1代后进行拟胚体培养。将部分3．5d拟胚体离心重悬后加入含有视黄酸的24孔板中进行诱导，另一部分加入已经培养有视网膜混合细胞的培养瓶中，培养液中同时也加入视黄酸。视网膜混合细胞中仅加入视黄酸未加拟胚体作为对照。倒置相差显微镜下观察细胞在整个诱导过程中形态学的改变并使用免疫细胞化学检测诱导细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、广谱细胞角蛋白、微管相关蛋白-2、视紫质蛋白表达情况。结果 (1)形态学改变仅由视黄酸诱导，诱导细胞呈多种形态；在共培养条件下，绝大多数拟胚体分化出来的细胞形态非常单一，呈透明圆形。部分原贴壁的视网膜细胞出现了明显的网状结构。(2)免疫细胞化学显示两种诱导条件均可见大部分诱导细胞MAP-2阳性，并可见Nestin阳性细胞。共培养诱导尚可见GFAP阳性、Cytokeratin阳性和Rhodopsin阳性的细胞。结论 视黄酸可以诱导大部分细胞成为神经细胞，在视黄酸和与视网膜细胞共培养诱导条件下，可以获得更为纯化的形态一致的神经样细胞，部分诱导细胞表达视网膜细胞的特性。     

绿色荧光蛋白基因gfp真核表达载体pcT K GFP的构建

目的：构建携带绿色荧光蛋白基因（ｇｆｐ） 的真核表达载体ｐｃＴＫＧＦＰ,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建提供基因材料。方法：采用ＰＣＲ技术从商品质粒ｐＥＧＰＣ１ 中扩增出ｇｆｐ（７９９ ｂｐ）,ＰＣＲ产物用ＸｂａⅠ和ＢａｍＨⅠ双酶切后定向克隆至真核表达载体ｐｃＴＫ,重组质粒ｐｃＴＫＧＦＰ用限制性内切酶和ＤＮＡ序列分析进行鉴定。结果：部分ＤＮＡ 序列分析证明ＰＣＲ产物为ｇｆｐ,成功筛选到携带ｇｆｐ 的真核表达载体ｐｃＴＫＧＦＰ。结论：ｐｃＴＫＧＦＰ真核表达载体的构建,为利用绿色荧光蛋白标记在实验动物体内进行自杀性基因治疗的研究和转基因动物打靶载体的构建奠定了基础。     

基因敲除动物的研究和应用

目的基因敲除动物是近十几年来发展起来的在个体水平上研究基因功能的一类实验动物,它以基因敲除技术和胚胎干细胞技术为基础,在生命科学研究的各个领域得到了广泛应用。最近两年发展起来的RNA干扰技术仍然不能代替它。本文综述了基因敲除动物在各医学生物领域的研究与应用、浅谈其与RNA干扰技术的比较及其发展前景。     

不同条件下培养小鼠胚胎干细胞

胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ细胞 )是从早期胚胎中分离出来的全能细胞系[1,2 ] 。当将这种细胞注入受体胚胎时 ,能参加各种组织器官的发育 ,形成嵌合体而后杂交至纯合体。通过ＥＳ细胞进行基因打靶[3 ] ,将外源基因定点整合产生基因剔除或基因修复从而制备转基因动物模型 ,故ＥＳ细胞可以用于研究基因的结构、功能及调控、医学疾病模型建立以及生殖细胞基因治疗等研究。利用ＥＳ细胞可以研究哺乳动物的分化和发育等基本问题 ,还可以通过研究ＥＳ细胞在体外定向诱导为特殊组织类型细胞为将来临床提供器官组织的原材…