敲除β珠蛋白βmaj及βmin基因的C129小鼠ES-D3细胞系建立

目的：通过构建C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj 及βmin 基因打靶载体，建立C129小鼠敲除β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj 及βmin 基因ES-D3细胞系，为制作基因敲除嵌合体小鼠提供稳定的胚胎干细胞系。 方法: 根据C129系小鼠β珠蛋白基因分子结构基础，用基因克隆方法在βmaj和及βmin两个同源序列两侧分别将1.7 kb和7.0 kb的片段插入pNTK质粒中，构建置换型打靶载体β-pNTK，用新霉素抗性基因（Neo）和 单疱病毒腺苷激酶（TK）抗性基因作为正负筛选标记。用Sal Ⅰ酶切将打靶载体β-pNTK线性化，采用电穿孔法在ES-D3细胞水平进行打靶，通过G418和GAN进行正负筛选，获得生长良好的胚胎干细胞克隆；用PCR和Southern印迹杂交方法鉴定阳性克隆基因组DNA整合结果，用碱性磷酸酶实验、体外胚体形成实验以及畸胎瘤成瘤实验鉴定细胞生物学特性。 结果: 构建了C129系小鼠置换型打靶载体，经Neo-Major鉴定引物PCR扩增、BamH Ⅰ及EcoR Ⅰ酶切及部分测序分析，所插入方向正确，结构合理，达到所预期的目的；获得了8个阳性克隆珠，阳性克隆细胞株经PCR和Southern印迹杂交方法鉴定外源基因整合到ES细胞基因组DNA中；经胚胎干细胞特性鉴定所获细胞具有良好的未分化特性和多能性。 结论: 构建了C129系小鼠β珠蛋白基因内源性珠蛋白βmaj 及βmin 基因置换型打靶载体；该载体在胚胎干细胞水平进行基因打靶后，获得了稳定的敲除β珠蛋白内源性珠蛋白βmaj及βmin 基因的胚胎干细胞系，为制作基因敲除嵌合体小鼠奠定了基础。     

胚胎干细胞C3B鼠视网膜下腔移植分化研究

目的：探讨胚胎干细胞在具有正常视网膜结构的C3B鼠视网膜下腔中的诱导分化情况。 方法:胚胎干细胞传1代后进行拟胚体培养。拟胚体消化成单细胞后联合视黄酸注入C3B鼠视网膜下腔，注射后1周、3周、2月处死小鼠取材进行病理切片、电镜检查和免疫组化检测。 结果:1周时，可见到注射部位视网膜层水肿增厚。3周和2个月时，3只移植眼内出现畸胎瘤，占所有移植眼的25%，其余眼球注射部位仅见瘢痕组织或眼球萎缩。电镜发现增殖的细胞核异型性明显，具肿瘤细胞特征。免疫组化显示：畸胎瘤部分区域MAP-2强阳性反应；可见团状或集落状细胞GFAP强阳性反应；个别细胞Nestin阳性反应。 结论:胚胎干细胞移植入具有正常视网膜结构的C3B鼠视网膜下腔，未能出现ESC向视网膜组织分化或嵌入视网膜组织，相当部分的鼠眼出现了畸胎瘤，其临床安全性和致瘤性是非常值得关注的问题。     

乳猪肝提取物和阿霉素对裸小鼠肾包膜下移植肝癌细胞增殖、分化和凋亡影响的实验研究

目的:探讨乳猪肝提取物(LE)和阿霉素(doxorubicin, DXR)对裸小鼠肾包膜下移植BEL-7402肝癌细胞增殖、分化和凋亡的影响。方法:应用裸小鼠肾包膜下移植肝癌细胞,形态学观察,有丝分裂计数,超微结构观察和原位DNA末端标记技术。结果:LE组和DXR组均能明显抑制移植肝癌细胞的生长和促进凋亡。LE对肝癌细胞有丝分裂影响不明显,而DXR能抑制其有丝分裂。电镜观察表明:LE能促进细胞凋亡超微结构的变化,表现为细胞固缩、微绒毛消失、核染色质边集固缩和凋亡小体形成,而对细胞分化影响不明显。DXR组除有凋亡待征的超微结构变化外,还具有促进肝癌细胞分化的作用。结论:LE能诱发移植于裸小鼠BEL-7402肝癌细胞凋亡,而对其分化和增殖影响不明显。DXR能促进裸小鼠肝癌细胞凋亡和分化,抑制其增殖。     

猕猴自体骨髓干细胞移植治疗急性肝损伤的实验研究

目的探讨自体骨髓干细胞肝门静脉移植对猕猴急性肝损伤的治疗作用和为人类肝损伤治疗提供依据和方法。方法猕猴10只,随机分为实验组和对照组,每日皮下注射40?L40.8ml/kg,连续注射4d,经肝功能生化指标检测及肝穿组织病理学观察确认肝损伤后,分离实验组猴的自体骨髓单个核细胞,按3×108细胞/kg将骨髓细胞植入肝门静脉,植入后60d进行肝功能相关指标检测及组织病理学观察。结果连续注射CCL44d后,血清谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、球蛋白(GLOB)(P<0.001),而总蛋白(TP)和白蛋白含量无变化(P>0.05),肝组织结构紊乱,大量肝细胞坏死,部分细胞变性,水肿,汇管区及周围有大量炎性细胞浸润。骨髓细胞肝门静脉移植后60d,血清AST、ALT活性和GLOB、BIL含量显著低于对照组(P<0.05),而TP、ALB、LDL含量高于对照组(P<0.05),病理组织学观察结构清楚,而对照组有纤维增生和肝细胞有脂肪变性。结论自体骨髓细胞肝门静脉移植能对猕猴急性肝损伤有明显治疗作用,可改善急性肝损伤猕猴的肝功能及组织结构,提示该方法可能对人类急性肝损伤有一定治疗意义。     

严密型四环素调控系统转基因首建鼠的建立

目的 制备ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠1,为严密型四环素调控系统的体内研究提供调控部分的转基因小鼠,以便与反应部分小鼠交配得到双转基因小鼠.方法 重组构建含目的 基因的质粒pApoE-rtTA-tTS,应用显微注射法将其注入母鼠的受精卵,再植入代母输卵管,出生小鼠经PCR初步筛选出阳性,再经Southern杂交对阳性小鼠基因组DNA标本进一步鉴定.结果 产生了2只整合ApoE-rtTA-tTS基因的首建鼠.结论 成功制备了ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠,为下一步建立严密型四环素调控系统的双转基因小鼠模型奠定了基础.     

严密型四环素调控系统转基因首建鼠的建立

目的制备ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠1，为严密型四环素调控系统的体内研究提供调控部分的转基因小鼠，以便与反应部分小鼠交配得到双转基因小鼠。方法重组构建含目的基因的质粒pApoE-rtTA-tTS，应用显微注射法将其注入母鼠的受精卵，再植入代母输卵管，出生小鼠经PCR初步筛选出阳性，再经Southern杂交对阳性小鼠基因组DNA标本进一步鉴定。结果产生了2只整合ApoE-rtTA-tTS基因的首建鼠。结论成功制备了ApoE-rtTA-tTS转基因小鼠，为下一步建立严密型四环素调控系统的双转基因小鼠模型奠定了基础。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应研究

目的　研究单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV1 TK)基因转染并联合抗病毒药更昔洛韦 (Ganciclovir ,GCV)对人胶质母细胞瘤细胞的杀伤效应。方法　采用基因工程技术构建带HSV1-TK基因的逆转录病毒重组体pLX SN TK ,采用脂质体介导入PA317包装细胞 ,建立重组逆转录病毒载体分泌细胞株PA317 TK ;用该细胞上清液转导人胶质母细胞瘤细胞 ,用不同浓度GCV作用人胶质母细胞瘤细胞SW0 38 C2 TK和野生型SW0 38 C2 ,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测 72h后细胞存活率 ,并求出半杀伤浓度。结果　重组逆转录病毒载体pLXSN TK能有效地将TK基因导入SW0 38-C2细胞内 ,并使其获得对GCV的敏感性 ;体外细胞毒实验 :在 2 0 μmol LGCV存在的情况下 ,野生型细胞无明显改变 ,而实验组细胞明显死亡 ,半杀伤浓度IC50 为 0 8μmol L ,与SW0 38 C2相比 ,对GCV的敏感性提高了 6 0 0倍 ,旁杀效果也较明显。结论　SW0 38 C2转染TK基因后 ,能有效地被GCV杀灭。显示了其潜在的临床应用价值     

大鼠原位肝移植的围手术期处理

目的 探讨大鼠原位肝移植实验的围手术期处理的特点。方法 在Kamada用“二袖套法”吻合血管的基础上进行改良。供体改经腹主动脉进行肝脏冷灌注，肝上下腔静脉用缝合法吻合，门静脉和肝下下腔静脉用袖套法吻合，胆总管采用单管内支架胆管端吻合法。结果 共施行大鼠原位肝移植360次，手术成功率为91．3％。非干预组中同系移植大鼠1周存活率为86．5％，3个月存活率达80．7％。结论 积极手术前准备，手术中熟悉步骤、主动配合、手术后耐心细致护理、密切观察、可以保证大鼠原位肝移植实验顺利进行、减少并发症的发生、提高动物的长期存活率。     

乳猪肝胶原水解物和促肝细胞生长素对裸小鼠肾包膜移植的人源性胰腺癌细胞的影响

目的：探讨乳猪肝胶原水解物（LCH）和促肝细胞生长素（pHGF）对裸小鼠肾包膜下移植人胰腺癌细胞（SW1990）的影响。方法：应用裸小鼠肾包膜下移植人胰腺癌细胞，瘤体积测量和组织细胞形态学观察。结果：高、中、低LCH剂量组和pHGF组的抑瘤率分别为58.22%、65.90%、55.23%和34.17%。而对胰腺癌细胞有丝分裂影响不明显。形态学观察表明，LCH和pHGF均能抑制肿瘤细胞生长，表现为细胞固缩,核染色质分叶固缩。结论：LCH和pHGF能抑制移植于裸小鼠肾包膜下的人源性胰腺癌细胞生长。     

嵌合体动物技术研究进展

嵌合体动物 (Ｃｈｉｍｅｒａｓ)是指由两种或两种以上具有不同遗传性的细胞系组成的聚合胚发育成的个体。早期嵌合体动物主要作为发育生物学中的一种十分有用的工具 ,用于研究胚胎发育过程中组织器官的发生等 ,1986年建立“胚胎干细胞 (ｅｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌ,ＥＳｃｅｌｌ)介导的转基因的途径”[1-2 ] ,可制作带有定点突变基因的动物品系。用基因打靶策略可以精确构建疾病的动物模型 ,在各个水平研究基因功能 ;用基因诱捕策略可以鉴定新基因和分析它们在生物现象中重要性 ,这是其他转基因方法所不能比拟的。嵌合体动物的获得…