人表皮干细胞体外分选和培养对构建组织工程皮肤种子细胞的可能性

目的：探讨人表皮干细胞在体外分选和培养的叮能性，为构建组织工程皮肤寻找理想的种子细胞。方法：实验于2002-01／12在中山大学基础医学院动物中心完成。根据表皮干细胞与Ⅳ型胶原蛋白的高黏附的特性，运用黏附实验将干细胞从培养在鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶的表皮细胞中分选出来，并从形态学、超微结构及免疫组化等方面进行了鉴定。结果：分选出来培养的细胞符合表皮千细胞的特征，说明分选培养的细胞是表皮干细胞。结论：预先在体外对表皮干细胞进行分选和培养是可行的，该细胞群有望成为构建组织工程皮肤的种子细胞，为下一步应用表皮干细胞构建组织工程皮肤奠定了牢固的基础。     

应用原瓶黏附分选表皮干细胞的方法学特点

目的：探索一种简单易行的方法分离表皮干细胞，为组织工程学的进一步研究奠定基础。方法：实验于2005—07／12在中山大学眼科中心国家眼科学重点实验室完成。健康3个月龄恒河猴2只，分离与培养猴表皮细胞，获取第2-4代的细胞，消化后，将细胞重新放回原瓶中，培养箱中静置20min，获得的贴壁细胞即为快吸附的表皮细胞。①于光学显微镜下观察分选前细胞和快吸附细胞。②对20min快吸附的表皮细胞进行整合素α6和CD71流式细胞仪检测，以未经吸附分选的细胞作为对照。③20min快吸附的表皮细胞和分选后未黏附细胞分别制作3组细胞爬片，进行整合素β1、K15、和K10的免疫组织化学染色。④20min快吸附的表皮细胞和分选后未黏附细胞进行K15、整合素β1和K1（K10对应角蛋白）的mRNA反转录聚合酶链反应的检测。结果：①分选后的细胞体积较小，核浆比例较大。②流式细胞仪的结果显示快吸附细胞以干细胞为主（α6^briCD71^dim为82．5&;#177;1．641），也含有少量的短暂扩增细胞（α6^briCD71^bri为4．9&;#177;2．125），有丝分裂后细胞及终末细胞则检测不到（α6^dim）。③免疫组化可见快吸附细胞呈K15和整合素β1阳性，K10阴性；分选后未黏附细胞K10为阳性，而K15和整合素β1均为阴性。④反转录聚合酶链反应示吸附分选后的快吸附细胞高表达K15和β1整合素，K10没有表达；而分选后剩余的细胞只表达K10。结论：原瓶黏附分选方法是一种简单可行的分选表皮干细胞的方法。     

三种荧光标记的短双链RNA体外转染特性的比较

目的:比较三种不同荧光标记的短双链RNA(siRNA)体外转染特性. 方法:利用脂质体LipofectamieTM2000转染三种荧光标记siRNA入小鼠胚胎成纤维细胞系NIH 3T3,流式细胞仪观察转染效率,普通倒置荧光显微镜观察其淬灭情况,激光共聚焦显微镜观察其在细胞内的分布情况. 结果:相同转染条件下三种荧光siRNA进入细胞的速度,细胞内的定位不同,转染效率不同,三种荧光标记的抗淬灭能力也不同. 结论:荧光标记siRNA可以起到良好的示踪作用. 用荧光标记siRNA作为无荧光siRNA的分布和转染效率参照时,要考虑到所选用荧光标记siRNA与无荧光标记siRNA的差异.     

基因打靶技术在转基因动物中的进展

80年代初发展起来的基因定位整合技术(gene targeting)以及同期建立的小鼠胚胎多潜能千细胞系(Es，emgbryonic stem cell)的体外培养方法，使转基因技术更加前进了一步，为人们在动物体内分析某一特定基因提供了有力的手段。转基因技术是将外源基因导入动物生殖细胞或ES细胞，也就是将动物原来没有的基因或不占主导地位的基因导入该动物的基因组中并使之表达，观察其表达后对动物产生的影响。而基因打靶技术则是应用外源DNA与染色体上一段与其具有高度同源性序列进行同源重组(homologous recombination)的原理使动物体内某种正常基因失活，     

胶原/纤维蛋白止血效果观察

目的研究胶原/纤维蛋白对新西兰兔的止血作用,并与胶原蛋白海绵止血效果作比较。方法选用胶原/纤维蛋白止血贴,对新西兰兔耳部动、静脉出血、耳表创面、股动脉割伤、肝损伤、体表创面进行止血试验,同时与胶原蛋白海绵止血效果作比较,观察其止血时间、失血量、敷料与创面的粘合等情况,并定期观察创面愈合、体内吸收和抗炎情况。结果胶原/纤维蛋白复合止血贴组、胶原蛋白海绵组新西兰兔耳动、静脉、耳表创面、股动脉割伤、标准肝创伤的止血时间与对照组比较,差异显著(P0.05)。胶原/纤维蛋白复合止血贴组新西兰兔耳动、静脉、耳表创面的止血时间与胶原蛋白海绵组,差异显著(P0.05)。胶原/纤维蛋白复合止血贴组、胶原蛋白海绵组动物的耳表创面、标准肝创伤失血量与对照组比较,差异显著(P0.05)。体内标准肝创伤、体表创伤后期观察,胶原/纤维蛋白复合止血贴与胶原蛋白海绵均能在21d内完全吸收,未见炎症反应。结论胶原/纤维蛋白复合止血贴对新西兰兔耳动脉割伤、耳静脉割伤、耳标创伤、股动脉割伤和标准肝损伤模型都具有明显的止血作用,体表创面伤口恢复良好,体内吸收速度快,具有一定的抗炎作用,而且在新西兰兔耳动脉、耳静脉割伤和耳表创伤的止血效果明显优于胶原蛋白海绵。胶原/纤维蛋白复合止血贴是一种较安全有效的局部止血生物材料。     

荧光定量RT-PCR技术分析人地中海贫血β654珠蛋白基因转基因小鼠mRNA的表达

目的 采用荧光定量RT-PCR技术检测所制作的人地中海贫血β^654珠蛋白基因转基因小鼠模型mRNA的表达情况,评价该技术应用于小鼠mRNA分析的价值.方法 根据GenBank小鼠mRNA序列,设计用于扩增小鼠mRNA的引物和反向探针,构建荧光定量RT-PCR技术.实验分两组,分别对转基因小鼠和正常小鼠中mRNA进行检测.采用SPSS统计软件,分析和比较两组动物中mRNA的表达量及表达的稳定性.结果 所检测的11只转基因阳性小鼠中检测出人β^654珠蛋白基因mRNA和小鼠内源性mRNA;而在33只正常小鼠中只检测到小鼠内源性mRNA.荧光定量RT-PCR技术可检测到105拷贝数的人β^654珠蛋白基因mRNA和115拷贝数的小鼠内源性mRNA.荧光定量RT-PCR技术分别在F1代和F2转基因阳性小鼠中稳定地检测到,表明转基因小鼠mRNA获得稳定表达.结论 所构建的荧光定量RT-PCR技术分析转基因小鼠mRNA表达具有检测定量、敏感、高效快捷的特点,该方法在鉴定和评估转基因小鼠mRNA的表达中稳定性好、定量准确,具有非常重要的应用价值.     

癌胚抗原肿瘤基因疫苗胶囊的研制

 目的研制癌胚抗原(CEA)阳性肿瘤基因疫苗结肠溶胶囊。方法通过分子克隆技术将加强型绿色荧光EGFP cDNA连接于CEA cDNA的上游,构建示踪子EGFP-CEA融合基因疫苗pVGC2。使用特制的微小结肠溶空心胶囊制备鼠用基因疫苗口服胶囊。收集小鼠口服用药后的腹腔游离细胞,采用荧光显微镜观察绿色荧光以便评估EGFP-CEA融合蛋白质的表达情况。结果所构建的重组质粒的目的基因片段测序结果证实所接入的EGFP-CEA cDNA序列与母本cDNA序列100%一致。所制备的口服胶囊的平均溶出度为(91.1±3.65)%。检测结果显示,口服胶囊后小鼠腹腔游离细胞中可见到绿色荧光。结论成功地制备了口服基因疫苗胶囊。小鼠腹腔游离细胞中绿色荧光融合蛋白的表达预示,口服基因疫苗胶囊是一种潜在可行的抗肿瘤免疫途径。     

表达丙肝病毒核心蛋白基因的人肝细胞模型的建立

目的 构建表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCV-C)基因的人肝细胞模型。方法用聚合酶链反应(PCR)方法从pHCV-MA质粒中钩出HCV-C基因，酶切纯化后克隆于质粒pTRE中，建立重组质粒pTRE-C。pTRE-C经酶切、纯化后目的片段与质粒PcDNA3连接，通过限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确重组质粒PcDNA3-tRe-C，由脂质体介导转染Chang-liver人肝细胞，建立表达HCV-C基因的人肝细胞模型，PCR方法鉴定Chang-1iver人肝细胞内HCV-C基因。反转录聚合酶链反应(RT—PCR)方法检测HCV—C基因在Chang—liver人肝细胞内的表达，抗生物索蛋白-生物素-过氧化物酶复合体法(ABC法)方法分析HCV核心蛋白在人肝细胞内的表达及定位。结果 构建了表达HCV-C基因的重组真核表达载体，并在Chang-1iver人肝细胞中表达出HCV-C蛋白。结论 成功地建立了表达HCV—C基因的人肝细胞模型，该模型为进一步研究HCV-C的生物学特性及HCV感染所致肝硬化、肝癌的致病机制提供基础材料。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肺腺癌细胞的表达

肺癌是目前最常见和最难治的肿瘤之一 ,发病率和病死率都很高 ,易发生转移。肺癌治疗目前主要依靠传统的手术、放射治疗和化学治疗 ,其疗效较差。随着分子生物学技术的发展 ,基因治疗肿瘤成为可能。“自杀基因”的出现因其能彻底杀伤肿瘤细胞 ,因而受到广泛重视 ,被认为是最有希望成为临床肿瘤治疗的有效方法。单纯疱疹病毒胸苷激酶(ＨＳＶ ｔｋ)基因是肿瘤基因治疗中最具前景的“自杀基因”[1] ,实验研究显示 ,导入ＨＳＶ ｔｋ基因的肿瘤细胞联合抗病毒药物更昔洛韦 (ＧＣＶ)治疗 ,可有效地杀伤肿瘤细胞并可使小鼠体内实体瘤完全消退[2 ] …     

视黄酸联合视网膜细胞培养上清液对胚胎干细胞体外分化的诱导作用

目的：探讨经过初步诱导的拟胚体在视黄酸和视网膜细胞培养上清液作用下的分化特征。方法：将胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)自液氮中复苏、培养，传1代后进行拟胚体(embry-onic bodies,EB)培养。3天半的EB离心重悬后不作消化，使用视黄酸、视黄酸加鼠视网膜胶质细胞和神经细胞培养上清液、视黄酸加人视网膜色素上皮培养上清液、视黄酸加人胎儿视网膜胶质细胞培养上清液(分别记为A、B、C、D组)等进行诱导。观察诱导过程中形态学改变，培养3周时使用免疫细胞化学检测Nestin、GFAP、cytokeratin、MAP-2、rhodopsin等在诱导后细胞中的表达情况。结果：(1)形态学改变：4种条件下的早期改变基本相同，均可见多种形态的细胞；3周后：拟胚体结构基本已散开，A组：见多种形态的细胞，细胞边界欠清，饱满度下降；B组：细胞以透明度较高的圆形细胞为主；C组：拟胚体及拟胚体周围的细胞中出现了含有明显色素的细胞；D组诱导：细胞胞体较大，形态结构较为单一；(2)免疫细胞化学：4种条件下均表现为大部分细胞MAP—2阳性，未见Nestin阳性细胞；此外，A组中，未见GFAP、Cytokeratin、Rhodopsin阳性细胞；B组中，可见GFAP、Cytokeratin、Rhodopsin阳性细胞；C组仅见Cytokeratin阳性细胞；D组仅见GFAP阳性细胞。结论：在KSC的次级诱导中，视黄酸可以诱导大部分细胞成为神经细胞，多种视网膜细胞的上清液在诱导中具有一定的作用，ESC能被诱导形成与上清液来源细胞相关的细胞。眼科学报2003；19：122-125