携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。【方法】以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点（MCS）的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪（FACS）观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况、以及对靶细胞生物特性的影响。【结果】成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP。【结论】使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础。     

小鼠胚胎干细胞植入大鼠脑内存活和增殖

【目的】观察小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )植入大鼠的隔区和海马内后存活和增殖的情况。【方法】以SD大鼠为宿主 ,将BrdU标记的ES细胞植入宿主的隔区和海马内 ,移植后l、2、3、4和 8周后取脑 ,冰冻切片 ,进行尼氏、BrdU、PCNA免疫组织化学染色 ,观察ES细胞存活和增殖的情况。【结果】ES细胞移植入大鼠隔区和海马内后 ,从第l周到第 3周 ,移植物呈团块生长 ,第 4周移植物较第 3周缩小 ,第 8周未发现移植物 ;BrdU和PCNA(核增殖抗原 )免疫染色结果阳性。【结论】小鼠ES细胞移植入大鼠隔区和海马内后 ,可以存活增殖 4周左右     

体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经干细胞的实验研究

目的:探讨体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESCs)分化为神经干细胞(NSCs)的可能性。方法: ESCs经胚胎体阶段, 以视黄酸及视网膜müller细胞诱导, 在NSCs选择性培养基中筛选培养扩增7d, 观察形态变化, 采用RT-PCR法检测nestin、glutaminase、Brn-3基因表达及免疫细胞化学法检测nestin等NSCs特异性标志物, 并对其扩增及分化能力进行观察。 结果:ESCs经初级诱导, NSCs选择性培养基筛选培养7d后, 形成大量神经球样结构, 可扩增传代。绝大部分神经球样结构呈nestin抗原阳性, 整合BrdU, 表达nestin、glutaminase、Brn-3基因, 且可分化为神经元及神经胶质样细胞。结论:视黄酸及müller细胞诱导的ESCs, 经选择性培养基筛选培养可获得NSCs, 有望为青光眼等神经变性疾病提供新的治疗途径。     

干细胞与肿瘤发生的关系

Stem ceils are a lineage with capacities of self- renewal and multipotential differentiation.They are exactly regulated by microenvironment where they live. With the understanding of stem ceils biology,researchers noticed that stem ceils have many similar biology characters with tumor cells, and thought that tu-mors were likely derived from stem ceils, and gave a concept that there were tumor stem ceils in tumor tissues.     

成体干细胞的可塑性及临床意义

成体干细胞（adult stem cells,AS细胞）存在于人他哺乳动物的各种组织中,具有自我更新他分化潜能。已证实骨髓、神经、肌肉、脂肪等多种组织中的干细胞具有多向分化潜能,可以打破胚层界限,横向分化为无关组织的成熟细胞。成体干细胞及其衍生的细胞、组织或器官移植治疗可能成为各种退行性疾病、肿瘤、免疫异常症等疾病治疗以及创作修复、组织器官功能重建的理想措施。     

BALB/cj小鼠胚胎干细胞系的建立及其嵌合体小鼠的产生

198 1年Ｅｖａｎｓ和Ｋａｕｆｍａｎ首次报道小鼠ＥＳ细胞系建立以来 ,由于ＥＳ细胞具有体外不断扩增、未分化状态和全能分化 3大特点 ,故ＥＳ细胞被广泛应用于基因同源重组 ,转基因动物产生、与生长、分化相关基因功能及调控的研究。应用之广涉及发育生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、药理学、毒理学等各个学科。尤其是在美国Ｗｉｓｃｏｓｉｎ大学ＪａｍｅｓＴｈｏｍｓｏｎ 1998年建立人胚胎干细胞系以来 ,更是成为当前生命科学的热门。胚胎干细胞建立及其嵌合体产生是一项与克隆技术相当的极其复杂的技术。我国开展胚胎干细胞分离培养技术…     

来源于胚胎干细胞的嵌合体小鼠自发性肿瘤观察

目的观察胚胎干细胞（ES细胞）囊胚腔注射的方法构建嵌合体小鼠自发性肿瘤。方法连续80周每周观察嵌合体小鼠的肿瘤发生情况,选取同龄相关品系小鼠各10只作为对照组。处死发生肿瘤的小鼠并且病理学检查,提取肿瘤组织的基因组DNA,用PCR方法检测性别决定区（SRY）基因判断肿瘤的品系来源。结果13只嵌合体小鼠中有3只（全为雌性）发生自发性肿瘤,分别为腺癌、皮下恶性畸胎瘤、淋巴瘤。肿瘤细胞来源于注射的ES细胞而非受体囊胚。对照组野生型小鼠未见肿瘤发生。结论ES细胞囊胚腔注射的方法构建嵌合体小鼠具有较高的自发肿瘤发生率,可作为自发性肿瘤动物模型。     

盆腔结缔组织炎大鼠模型的层黏连蛋白表达

目的 建立混合菌液致SD大鼠盆腔结缔组织炎模型,研究大鼠盆腔黏连组织的病理学改变与层黏连蛋白表达.方法 用注射器将细菌混悬液0.5 mL,注入大鼠盆腔,并结合子宫穿孔手术,建立SD大鼠盆腔结缔组织炎模型.采用Philips分级评分法对大鼠盆腔黏连程度分级评分,切取黏连组织,用多聚甲醛固定,进行病理检测,并采用免疫组化法测定层黏连蛋白表达情况.结果 模型组大鼠盆腔黏连Philips分级评分以Ⅲ级为主,与正常对照组比较差异极显著.HE染色镜检模型组可见大量炎细胞浸润,脓肿形成,伴有多少不等的纤维组织增生.免疫组化染色镜检模型组可见层黏连蛋白高表达,纤维结缔组织增生程度越高,层黏连蛋白表达越多.结论 盆腔注射混合菌液并结合子宫穿孔手术,可作为建立大鼠盆腔结缔组织炎模型的方法.层黏连蛋白在盆腔结缔组织炎发病中起重要作用,参与整个炎症过程并维持盆腔黏连组织纤维化,可作为判断盆腔结缔组织炎的炎症和纤维化程度的参考指标.     

来源于胚胎干细胞的嵌合体小鼠自发性肿瘤观察

目的观察胚胎干细胞(ES细胞)囊胚腔注射的方法构建嵌合体小鼠自发性肿瘤。方法连续80周每周观察嵌合体小鼠的肿瘤发生情况,选取同龄相关品系小鼠各10只作为对照组。处死发生肿瘤的小鼠并且病理学检查,提取肿瘤组织的基因组DNA,用PCR方法检测性别决定区(SRY)基因判断肿瘤的品系来源。结果13只嵌合体小鼠中有3只(全为雌性)发生自发性肿瘤,分别为腺癌、皮下恶性畸胎瘤、淋巴瘤。肿瘤细胞来源于注射的ES细胞而非受体囊胚。对照组野生型小鼠未见肿瘤发生。结论ES细胞囊胚腔注射的方法构建嵌合体小鼠具有较高的自发肿瘤发生率,可作为自发性肿瘤动物模型。     

携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

 【目的】 构建携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响｡ 【方法】 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点(MCS)的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪(FACS)观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况､以及对靶细胞生物特性的影响｡ 【结果】 成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制｡高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP｡ 【结论】 使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础｡