携带EGFP基因的逆转录病毒载体的构建及初步应用

【目的】构建携带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的逆转录病毒载体,观察GFP的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。【方法】以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应,获得完整保留pEGFP-C1载体多克隆酶切位点（MCS）的EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后获得具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪（FACS）观察EGFP做为报告基因在体外的表达情况、以及对靶细胞生物特性的影响。【结果】成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并稳定表达,对靶细胞的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98%的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30%细胞表达GFP。【结论】使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低,所构建的pLXSN-EGFP载体可在体外稳定表达,为再插入治疗用基因进行后续研究奠定基础。     

悬滴培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为肝样细胞

目的: 与平板培养比较,探讨悬滴三维培养对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)肝样分化的诱导效应。方法: 对rMSCs进行悬滴培养,以肝细胞生长因子(HGF)作为诱导因子,同时设定平板培养诱导和非诱导对照组,在培养第7、14和21 d后,通过RT-PCR法和免疫荧光技术检测白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(APF)和角蛋白(CK-18)在mRNA和蛋白水平上的表达情况,并通过ELISA检测培养液上清中ALB的分泌。结果: HGF悬滴培养的rMSCs形成球状三维结构,内部呈现空囊样结构,大量细胞聚集在球体外侧面;在第7 d就出现ALB和CK-18的强阳性表达,而AFP则表达较弱。HGF培养的单层rMSCs直到第14 d才出现ALB、AFP和CK-18 mRNA的弱阳性表达,蛋白表达则在第21 d才呈现阳性。ELISA检测到HGF悬滴培养后rMSCs能够胞外分泌ALB,与正常和平板培养诱导组比较差异显著(P<0.01)。结论: 悬滴培养为rMSCs创造一种球形三维培养微环境,在HGF的诱导作用下,rMSCs横向分化为肝样细胞。     

提高大鼠实验性肝硬变模型存活率的研究

目的探讨提高大鼠肝硬变模型制作存活率的方法.方法将120只雄性SD大鼠随机分为3组：实验1组（40只）：CCL4＋10%乙醇,10%乙醇作为唯一饮料;实验2组（40只）：CCL4＋30%乙醇,在基础饲料添加20%猪油、0.5%胆固醇连续喂养2周,30%乙醇在进行CCL4注射前用于灌胃,用高压消毒的水作为饮料;正常对照组（40只）：按常规饲养.观察两种方法诱导大鼠实验性肝硬变模型的存活率和肝组织的病理变化.结果实验1组（40只）SD大鼠肝硬变模型诱导8周共死亡15只,存活率为62.5%;实验2组（40只）8周共死亡2只,存活率为95%（P＜0.05）.结论在进行CCL4皮下注射前用乙醇作间歇性灌胃可以明显提高大鼠肝硬变模型的存活率。     

非小细胞肺癌裸鼠体内肿瘤药物筛选分析及其临床应用

目的 评价非小细胞肺癌裸鼠体内肿瘤药物筛选结果及临床应用疗效。方法 新鲜非小细胞肺癌组织块植入裸鼠肾包膜下,选用常用抗非小细胞肺癌药物进行肿瘤药物进行肿瘤药敏试验,临床实验组依据肿瘤药敏结果进行肺癌根治术后辅助化学治疗;临床对照组选取同期非小细胞肺癌根治术后接受ＣＡＰ方案辅助化学治疗。结果 人体癌细胞植入裸鼠体内后能很好地保持肿瘤细胞形态,移植瘤细胞可见率为８７．８％,临床实验组３ａ生存率为６０．     

肝脏特异性可调控丙型肝炎病毒核心蛋白表达的转基因小鼠模型的建立

 【目的】制备TRE-HCV-C转基因小鼠，为四环素调控系统的体内研究提供了反应部分的转基因小鼠。以便与本实验室同时建立的调控部分的小鼠共同作用，为进一步建立双转基因小鼠模型奠定基础，更为丙型肝炎病毒核心蛋白（HCV-C）的发病机制的研究提供一个实用方便的模型。【方法】重组构建含有目的基因HCV-C、TRE序列和SV40polyA的转基因载体pTRE-HCV-C．以显微注射的方法将l_153kb的转基因片段注人BALB／C母鼠的受精卵．出生动物及其后代经PCR初步筛选出阳性．再经Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定。用转基因阳性小鼠和整合有肝脏特异性启动子ApoE和胛A基因的另一品系转基因小鼠杂交，得到子代F1小鼠，通过免疫组织化学来初步检测HCV-C在肝脏中特异性的可调控性的表达。【结果】产生了5只整合有TRE-HCV-C基因的首建鼠，以及它的子代也带有此基因。与基因组上整合有肝脏特异性启动子ApoE和rtTA基因的转基因小鼠杂交后，得到子代F1小鼠。特定时问与DOX作用后，小鼠肝脏的免疫组织化学结果表明，TRE-HCV-C小鼠为丙型肝炎病毒核心蛋白的发病机制研究提供了一个良好的动物模型工具。【结论】成功制备了HCV-C转基因小鼠，可利用四环素调控系统来研究HCV中的C基因对小鼠的作用，为进一步建立四环素调控系统调控下表达HCV-C基因双转基因小鼠模型奠定基础．也是HCV-C基因功能研究及与肝细胞癌的关系的机制研究的一个有用工具。     

小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为精原干细胞的研究

目的:初步探讨在体外条件下诱导小鼠胚胎干细胞(EGFP-mESC)分化为精原干细胞(SSC)的条件,建立有效的技术平台。方法:采用部分模拟胚胎早期发育的方法,将EGFP-mESC(XY)经体外悬滴培养,制备拟胚体(EB);使用免疫磁珠分选法从EB中分离出表达原始生殖细胞(PGC)表面标志SSEA-1的细胞;获得的细胞经2μmol/L维甲酸(RA)诱导增殖,使之向雄性生殖细胞分化。对诱导的细胞采用RT-PCR及免疫荧光检测特异性基因及蛋白的碱性磷酸酶。结果:在诱导EGFP-mESC向雄性生殖细胞分化的过程中,采用RT-PCR方法检测到了雄性生殖细胞特异表达基因Sry、fragilis、stella、Tex14等mRNA的表达;利用激光共聚焦方法检测到SSC表面标志蛋白Stra8、integrin-α6及Hsp90α的表达。结论:采用RA体外诱导EGFP-mESC定向分化为SSC是可行的。     

tTS/rtTA系统下调目的基因基础表达的细胞模型研究

[目的]构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型.[方法]通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素（1 mg/L）诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆.[结果]带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株（192：21）,其中克隆9的诱导倍数最高（256）,获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株.[结论]荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性.     

干细胞在妇产科领域的研究和应用前景

干细胞研究，已取得了举世瞩目的成就。干细胞及其衍生组织器官的临床应用，必将导致一次医学革命，产生一种全新的治疗技术。干细胞是一类具有自我更新和增殖分化能力的细胞，可以产生出与细胞自身完全相同的子细胞，同时还可以分化为仍保持干细胞特性的祖细胞。按分化阶段不同，干细胞可分为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)     

原癌基因 c- kit mRNA在自身免疫性睾丸炎中的表达及意义

 [目的]探讨原癌基因c-kit mRNA在自身免疫性睾丸炎中的表达及意义.[方法]建立并分析自身免疫性睾丸炎动物模型：42只BALB/c小鼠随机分为6个实验组和1个对照组.6个实验组小鼠分别给予KM小鼠睾丸混悬液皮下注射,每周1次最多者4次,在第1次给予抗原注射后1,2,3,4,6,8周各取一组小鼠的睾丸组织,用RT-PCR检测其c-kit mRNA的变化.[结果]在第1次给予抗原注射后第1周开始c-kitm RNA转录水平开始降低,第2周起明显低于对照组（P＜0.05）,至第3,4周降至最低,第6周逐渐开始恢复,至第8周其水平与对照组相比差异已经没有统计学意义（P＞0.05）.[结论]c-kit基因与生精功能密切相关,c-kit基因mRNA的低表达可能参与自身免疫性睾丸炎导致不育的发病机制.     

原发性中枢神经系统恶性淋巴瘤(附2例报告)

原发性中枢神经系统恶性淋巴瘤十分罕见。Kernohau和Vihlein在他们见到的8,070例脑肿瘤中诊断了40例原发性脑淋巴瘤,约占0.5%;Coy Freeman等在1950～1964年之间的1.157例淋巴瘤中搜集到23例原发性颅内淋巴瘤,约占0.18%;Henry等统计11,712例恶性淋巴瘤有82例原发于中枢神经系统,约占0.7%。回顾国内文献,仅梁国桢等与李仁等各为个例报道。本文报告2例(尸检、活检各1例)如下,并复习了文献。