酵母双杂交技术筛选乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白的研究

目的　筛选与乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶-N末端蛋白 (TP)相互结合的肝细胞蛋白 ,进一步探讨TP的生物学功能。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增TP片段 ,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH 10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酶 (X-α-gel)上进行双重筛选阳性菌落 ,DNA序列测定并进行生物信息学分析。结果　成功获得了 4 7个与TP特异性结合的阳性克隆 ,包括人类固醇调节元件结合蛋白 1(SREBP1)、RNA聚合酶Ⅱ亚单位 (hsRPB7)、血浆铜蓝蛋白(CP)等 2 1种已知功能蛋白质基因和 19个假设蛋白基因。结论　HBVDNA聚合酶-TP可以与某些已知和未知功能蛋白相互结合 ,提示其具有较广泛的生物学功能     

酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒 DNA 聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨 TP 的生物学功能。方法酵母双杂交相关实验材料购自美国 Clontech公司,其中 pACT2为人肝配合表达的 cDNA 文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为 HL4024AH。pGBKT7-53和 pGADT7-T 中的 p53和大 T 抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam 中的 Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照。含有 AF384372 HBV DNA P 全基因组 cDNA 的质粒 G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存。TP 基因的上下游引物序列分别为:5′-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTFA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶 EcoRI 和 BamHI 的酶切位点。引物合成及 DNA 测序由上海博亚公司完成。用聚合酶链反应(PCR)技术扩增 TP片段,连接人酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞 AH109并在其内表达,挑取在 SD/-Trp 培养基上的转化子-即 pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×10~9个细胞/ml),与转化了人肝 cDNA 文库质粒 pACT2的酵母细胞 Y187配合,生长6～18 d 后把长出的>2 mm 的酵母集落,在铺有 X-α-gal 的 QDO 培养基上检查α-gal 活性,蓝色菌落为真阳性集落。挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的 SOB 平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序。提交 GenBank 分析。结果成功得到47个与 TP 特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein)。筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP 糖基转移酶1家族多肽 A9;CD14抗原;B 糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW 域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S 蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素 E 亚基;Z 蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆 RP11-107P7;RNA 聚合酶Ⅱ亚单位 hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白 L 链。19个假设蛋白的同源性在97%～100%。结论 TP 蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能。     

胆道铸型综合征的发病机制与诊治

胆道铸型综合征（BCS）是指肝移植术后充填于肝内外胆道的坏死物质形成胆道树样的铸型,并由此引起的一系列临床表现,是肝移植术后少见但非常严重的并发症。了解BCS的病因、发病机制以及临床表现,有助于预防BCS的发生,提高肝移植术后BCS患者的生存率,笔者就此及BCS的诊治方面作一综述。     

慢性肝病患者血小板减少原因及治疗研究进展

血小板减少症是慢性肝病患者常见并发症之一,尤其肝硬化患者血小板减少症发生率更高,且病情更严重。文献[1]报道,超过76%的肝硬化患者并发血小板减少症。另外,严重的血小板减少（血小板计数〈50×109/L）可能与致死性肝病相关[2]。肝病患者发生血小板减少症的原因非常复杂,目前业界认为,可能与脾功能亢进、病毒感染后骨髓抑制、免疫等诸多因素有关。临床上针对血小板减少的治疗方法也较多。     

慢性乙型肝炎病毒感染和原发性肝细胞肝癌

原发性肝细胞肝癌在中国发生率和病死率一直较高,慢性乙型肝炎病毒感染在肝癌的发生、发展和预后等方面都占据着非常重要的地位.乙型肝炎病毒感染所致的慢性肝炎、肝硬化、肝癌三步曲是最常见的肝脏疾病进程.本文从乙肝病毒、宿主以及抗病毒治疗3个方向就慢性乙型肝炎病毒感染与原发性肝细胞肝癌进行了系统综述.     

乙型肝炎病毒前S2蛋白下调胰岛素受体启动子的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)前S2蛋白对胰岛素受体(INSR)启动子转录的下调作用.方法 HBV前S2蛋白真核表达质粒pcDNA3.1(-)-preS2及INSR启动子真核报告质粒pCAT3-INSRp使用常规分子生物学方法进行构建,并经酶切、测序证实.接下来,将构建好的pcDNA3.1(-)-preS2质粒以1.0、1.5、2.0μg转染HepG_2细胞,提取总RNA后进行相对实时荧光定量PCR检测以明确前S2蛋白mRNA的表达量.然后,分别将pCAT3-INSRp质粒以0.2μg递增量(0～2.0μg)转染HepG_2、Huh7细胞系,CAT-ELISA法检测转染细胞的氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达量以制作pCAT3-INSRp的量-效曲线.最后,根据量一效曲线选择合适的pCAT3-INSRp转染剂量(1.0μg)与不同剂量的pcDNA3.1(-)-preS2(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μg)共转染HepG_2及Huh7细胞,同时使用抗前S2蛋白单克隆抗体以阻断前S2蛋白的作用,使用CAT-ELISA方法检测转染细胞的CAT表达量,以观察前S2蛋白对于INSR启动子的调节作用.结果 转染了pcDNA3.1(-)-preS2的细胞可以正确表达HBV前S2蛋白的mRNA.pCAT3-INSRp质粒转染细胞后CAT的表达随着转染剂量的增加而增加,量-效曲线为S形.转染不同剂量pcDNA3.1(-)-preS2后,HepG_2细胞内CAT基因的表达水平分别为对照的69.8%、60.1%、19.7%、10.3%、5.6%(转染后36 h)和68.6%、56.0%、10.3%、8.6%、3.2%(转染后72 h).同时,在转染2.0μg pcDNA3.1(-)-preS2的细胞培养上清中加入前S2单抗后,其CAT的表达量恢复为对照的55.4%(36 h)和69.7%(72 h).Huh7细胞的结果同HepG_2细胞结果相似.结论 克隆的INSR启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的前S2蛋白对INSR启动子转录具有下调作用,可以在分子水平解释肝源性糖尿病发病机制的一部分.     

基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒DNA多聚酶P结构域反式调节基因

目的：应用基因芯片技术，对乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)聚合酶P结构域蛋白／逆转录酶(PR)的基因表达谱进行分析，探索PR对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法：设计并合成PR基因序列特异性的引物，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增PR蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术将获得的PR编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定，构建真核表达载体pcDNA3．1(-)-PR。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取mRNA，逆转录为cDNA，与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果：基因芯片技术所检测的1152个基因表达谱的筛选中，79条基因表达水平上调，90条基因表达水平下调。结论：应用基因表达谱芯片成功筛选了HBVDNA聚合酶PR转染细胞后差异表达基因，为进一步阐明PR蛋白可能的分子生物学机制提供依据。     

瞬时弹性扫描仪测定中国人慢性乙型肝炎患者肝脏硬度的影响因素分析

目的观察瞬时弹性扫描仪测定中国慢性乙型肝炎病人硬度值的影响因素。方法对110例中国慢性乙型肝炎患者应用瞬时弹性扫描仪进行检测,根据ALT情况分为3组,观察肝弹性值及各个血清学指标有无明显差异。结果经统计学检查,三组患者在年龄、性别方面无显著差异;A、B、C三组在肝弹性值、ALT、AST、TBIL水平上均有明显差异,A、B两组与C在ALP指标上均有明显差异,而三组在GGT及PLT水平检测未见明显差异。三组分别进行前后两次成组比较,发现A组在所关注的指标中均无差异。B组在肝弹性值、ALT、AST指标有所差异。C组在肝弹性值、ALT、AST、TBIL指标有所差异。B、C两组LSM与ALT呈显著相关性。随ALT下降此2组LSM绝大部分逐渐降至肝硬化界值17KPa以下。结论当患者ALT升高程度在2倍以上时肝弹性值会受到影响,在10倍以上升高时影响更为明显。当ALT明显升高时,动态观察LSM会更准确的判定肝纤维化的程度。     

慢性乙型肝炎的治愈现状

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）是一种广泛的全球感染性疾病,是肝细胞癌和肝衰竭的主要原因。目前可以通过接种乙型肝炎疫苗降低CHB的新发感染率,主要的治疗方法是通过聚乙二醇化干扰素α和核苷（酸）类似物抑制病毒,延缓CHB患者的疾病进展,但不能治愈CHB。如何清除稳定的DNA中间体共价闭合环状DNA,以及如何恢复肝脏微环境中疲惫的免疫系统是目前面临的挑战。为此肝病学者们不断探索新的靶标和药物,研究通过针对HBV生活周期不同阶段的药物联合疗法实现持久功能性治愈。本文将对目前CHB的多种治疗策略以及正在研发的新靶标和新药物进行回顾。