液相芯片检测轮状病毒和诺如病毒方法的建立

目的建立一种多重PCR结合液相芯片技术同时检测A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的方法。方法建立多重PCR扩增方法,将PCR产物与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,利用Luminex 200液相芯片检测仪来检测杂交结果。对建立的A型轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒液相芯片检测方法进行灵敏度、干扰性分析,并应用该方法对68份粪便样品的核酸进行检测。结果灵敏性实验结果表明,该方法对GII型诺如病毒的检测灵敏度较高,检出限为10 pg/PCR;对轮状病毒的检出限为100 pg/PCR;该方法对GI型诺如病毒的检测灵敏度较低,检出限为1 ng/PCR。干扰性实验结果表明,轮状病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒的液相芯片检测,当病毒之间的模板量不同时(1∶1、1∶2、2∶1、1∶5、5∶1、1∶10、10∶1、1∶100、100∶1),仍能够准确检测;对68份临床粪便样品的核酸进行检测,检测出A型轮状病毒样品19份,GI型诺如病毒样品1份,GII型诺如病毒样品18份;轮状病毒和GII型诺如病毒混合感染1份,GI和GII型诺如病毒混合感染1份。结论本研究建立的轮状病毒和诺如病毒液相芯片检测方法通...     

耒阳地区中枢神经系统感染的病原学分析

目的探讨耒阳地区中枢神经系统感染患者病原学感染特点。方法通过检测患者血清中特异性抗体或对脑脊液中病原体进行分离培养从而加以鉴定。结果144例患者中以病毒感染最为常见,其中单纯疱疹病毒感染占18．8％,其次为结核杆菌（11．1％）和脑膜炎双球菌（6．25％）感染。结论病毒是中枢神经系统感染性疾病的常见病原,结核杆菌和脑膜炎双球菌感染也占一定比例。     

深圳市输入性寨卡病毒分离株的进化分析及生物学特性研究

目的 对从深圳宝安国际机场口岸入境的1例自柬埔寨归国发热人员进行寨卡病毒实验室检测,研究寨卡病毒分离株的遗传进化和生物学特征,为寨卡病毒病的预防控制提供参考依据。方法 采集患者血液、唾液和尿液样本,采用荧光RT-PCR方法进行寨卡病毒核酸检测;选用多种组织培养细胞分离病毒,分别观察病毒株的致病变效应、空斑形成及病毒滴度等,并对两株病毒基因序列进行分子遗传进化研究,分析输入性病例来源。结果 荧光RT-PCR结果显示,该病例血清、唾液以及尿液样本寨卡病毒核酸阳性并持续一段时间。首次成功从唾液和尿液标本中分离到寨卡病毒株,将其分别命名为ZIKV/S/SZ1901和ZIKV/U/SZ1901。两分离株均可引起Vero细胞病变,不引起BHK-21细胞病变;均可在Vero细胞中形成空斑,滴度分别为3.4×10⁵ pfu/mL、1.4×10³ pfu/mL。RT-PCR扩增出预期大小约10 272 bp片段,测序结果表明该片段与ZIKV/Hu/Thai/KngSG/17-D501株相应序列的同源性为99.6%。系统进化树显示该病毒属亚洲谱系,与输入至我国的其它寨卡病毒株位于不同的进化分支。寨卡病毒编码区氨基酸位点分析提示,SZ1901毒株在结构基因的氨基酸位点(D683E、V763M、T777M)和非结构基因NS1基因的(A188V)变异与近几年流行株完全相同。结论 根据患者流行病学史、临床表现和实验室检测结果,确诊该病例为深圳市从柬埔寨输入性寨卡病毒感染病例,且寨卡病毒分离株具备与2016年以来流行的寨卡病毒大部分相同的分子基础。     

2011-2012年深圳市呼吸道腺病毒分子分型及其流行特征

目的了解2011—2012年深圳地区致病性呼吸道腺病毒（AdV）的病原体基因亚型和遗传进化及其流行特征．分析深圳地区呼吸道腺病毒的流行规律和传播途径。方法收集2011年1月至2012年12月深圳地区31个流感样病例监测哨点2822份样本,先用荧光定量PCR方法筛查流感样病例,筛查后的阴性样本进一步进行呼吸道腺病毒等13种常见呼吸道病毒的核酸检测。对检测出的109份腺病毒阳性标本进行病毒分离,感染Hep-2受体细胞后共获得71份AdV稳定细胞毒株,用腺病毒六邻体基因作为靶基因,扩增其中的50份腺病毒阳性标本,纯化扩增产物后直接用于序列分析,在GenBank上进行序列比较,确定其病毒亚型并进行系统进化分析。结果2011—2012年深圳市腺病毒感染患者的高发年龄段人群为小于7岁的儿童,1～2岁婴幼儿发病率最高;4-6月和10—12月为每年发病高峰期。在2822份流感样病例咽拭子标本中,经定量PCR方法确定为AdV核酸阳性共109份,核酸阳性率为3．86％,从109份核酸阳性样本中分离病毒7l份,病毒分离率为68．93％。50份分离的呼吸道腺病毒分子分型结果为1型AdV6例,占12％;2型AdV4例,占8％;3型AdV27例,占54％;4型AdV3例,占6％;5型AdV4例,占8％;7型AdV5例,占10％;另外有复合型AdV（HAdV—un）1例,占2％。结论近两年来深圳地区呼吸道Adv感染以3型为主,腺病毒引起的呼吸道疾病主要发生在每年的4—6月,感染人群主要是1~2岁婴幼儿。     

实时荧光PCR和RT—PCR方法检测登革病毒的比较研究

目的通过2种检测登革病毒方法的比较，以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法利用Taqman MGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT—PCR及荧光PCR扩增。结果RT—PCR检测10份临床血清标本，2份阳性，阳性率为20％。实时荧光PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应，检测10份临床血清标本，5份阳性，阳性率为50％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。     

丙型肝炎病毒Core基因重组表达载体Pet32a-Core的构建

目的扩增丙型肝炎病毒核心区（HCV-Core）基因，并构建HCV-Core基因的重组表达载体。方法设计合成HCVCore基因全长引物，提取丙型肝炎患者血清中的HCVRNA，应用逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）扩增c区基因片段，用限制性内切酶BamH1和SaL1双酶切后，连接到Pet32a表达载体中，并转化到BL21大肠杆菌中：然后PCR和双酶切鉴定转化茵落。结果扩增得到目的基因长度约600bp，经测序证实为HCV-Core基因，表明HCV-Core基因重组表达载体Pet32a-Core构建成功。结论成功构建HCV-Core基因表达载体Pet32a-Core，为下一步Core蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定基础。     

深圳市一起肠道病毒71型引发手足口病流行的基因型别分析

目的 对2004年深圳市一起肠道病毒71型(EV71)引发手足口病流行的基因型别分析.方法 用EV71型特异性引物进行RT-PCR,并对EV71的VPl和VP4基因进行克隆,所得的序列与EV71型A、B、C基因型代表株的核苷酸序列用TreeView和PHYLIP软件(3.6b)进行系统进化分析.结果 4株病毒与C基因型代表株比较接近,VP1区核苷酸同源性在87.8%～92.0%之间,VP4区核苷酸同源性在85.9%～87.4%之间;与A、B基因型代表株比较差异较大,VPI区核苷酸同源性为81.9%～84.2%,VP4区为80.6%～85.0%;4株病毒VP1核苷酸同源性为94.1%～99.8%,VP4同源性为100%,组成一个独立的小分支.结论 对EV71的VPI和VP4区进行基因进化分析,可得出类似的结果 ,4株EV71深圳流行株可命名为C4亚型.     

首次从深圳市登革热患者血清中分离到一株登革4型病毒

目的:对深圳市2005年登革热病原体进行分离鉴定.方法:采用酶链免疫吸附试验法和胶体金免疫层析法检测登革热疑似患者血清中的特异性IgM和IgC抗体.用C6/36细胞对早期病例血清进行病毒分离,以MGB荧光PCR方法鉴定.用逆转录-套式PCR方法对其进行型别鉴定.结果:从8份标本中成功分离到一株登革病毒,经逆转录-套式PCR方法鉴定为登革4型病毒,将其命名为DEN4-SZ0524.结论:首次从2005年登革热患者血清中分离到一株登革4型病毒,为进一步研究和控制该地区登革热提供了科学依据.     

对沙眼衣原体感染细胞促凋亡蛋白表达的影响

目的：研究蛋白酶体抑制剂MG132对沙眼衣原体感染细胞促凋亡蛋白Bim、Puma表达的影响，探讨沙眼衣原体抑制宿主细胞凋亡的可能机制。方法：以沙眼衣原体（D血清型）感染Hela229细胞，用不同浓度MG132作用后，Western-blot检测Bim、Puma蛋白质表达水平的变化。结果：沙眼衣原体感染12h后Bim、Puma的表达降低；24h后完全消失。MG132能抑制Bim、Puma的表达下降。结论：沙眼衣原体感染Hela229细胞后可降低促凋亡蛋白Bim、Puma蛋白质的表达；MG132可阻止这一作用，Bim和Puma的降解依赖蛋白酶体的活性。