深圳市首例基孔肯雅病毒的形态学及分子遗传特征分析

目的 对深圳市首发基孔肯雅病毒(CHIKV)进行分离、增殖培养、浓缩、形态学观察及构建系统发生树分析,为后续基因组信息解析、蛋白组分析、单克隆抗体制备及疫苗研发等应用性研究提供实验基础.方法 利用C6/36细胞从病人血清中分离CHIKV,采用BHK-21细胞对CHIKV进行大量的增殖培养,经7％PEG8000浓缩,超薄切片和负染观察CHIKV显微结构;对分离得到的CHIKV株进行全基因组测序和构建系统发生树,结合流行病学资料对其分子遗传特征进行分析.结果 CHIKV被成功分离并浓缩;在透射电镜下观察CHIKV的直径约为70 nm,圆形有包膜,表面有纤突;CHIKV(SZ-20101028)基因组长为12 377bp,属于E1-A226突变株;该病毒是最近10年来在印度洋岛屿爆发流行的新亚型,与流行病学调查资料相吻合.结论 以现有的条件建立了一种稳定、快速培养浓缩CHIKV的方法,并初步对CHIKV进行了形态观察和溯源性分析.     

槲皮素对内毒素性心肌损伤的保护作用及机制

目的观察槲皮素对内毒素心肌损伤心肌的保护作用。方法C57BL/6J 小鼠随机分为阴性对照组、槲皮素对照组、内
毒素血症组以及槲皮素干预组。阴性对照组给予等体积生理盐水腹腔注射,槲皮素干预组大鼠食用含按槲皮素的鼠饲料
（100 mg/kg）。内毒素组小鼠腹腔注射LPS（10mg/kg）诱导内毒素血症模型。槲皮素干预组大鼠先食用含槲皮素（100 mg/kg）
的饲料7 d后,腹腔注射LPS（10mg/kg）。6 h后超声心动仪测定小鼠心功能;Western blot法检测小鼠心肌组织Bax、Bcl-2、NOS
和eNOS表达水平,以及血清中NO含量。同时,记录小鼠5 d生存率,并描绘生存曲线。结果槲皮素预处理后,与内毒素组相
比,小鼠心肌功能显著得到了改善;内毒素组小鼠心肌组织中iNOS蛋白水平增高,eNOS水平降低。而经槲皮素干预后,iNOS
蛋白表达量明显降低,eNOS表达水平增高;LPS处理后,Bax显著增高,Bcl-2轻微降低。槲皮素干预后,Bax降至对照组水平,
Bax/Bcl-2比值降低;内毒素组小鼠血清NO水平增高近3.5倍。槲皮素处理后,NO含量明显降低(P<0.05);内毒素组5d后小鼠
生存率为10%,而槲皮素干预组生存率达45%（P<0.05）。结论槲皮素可减轻LPS 所致的小鼠心功能不全,改善生存率。
     

深圳市一起急性出血性结膜炎爆发的分子特征分析

目的快速检测深圳市2007年一起急性出血性结膜炎爆发流行的病原并分析其基因进化。方法采集8例疑似急性出血性结膜炎患者的眼拭子标本,提取病毒核酸。用三套可能引起急性出血性结膜炎的病原体的特异性引物进行PCR反应,根据扩增产物琼脂糖凝胶电泳所产生的目的条带快速判定病原体类型。将扩增产物测序后,与不同地区、不同时期相应病原体的毒株进行同源性比较和进化树分析。结果在8例疑似急性出血性结膜炎患者中检测出5例柯萨奇病毒A24型变异株阳性,阳性率为62.5%。基因进化分析显示这5株柯萨奇病毒A24型变异株的VP4序列的组内核苷酸同源性为100%,与同时期广东省流行的CA24v毒株的VP4序列亲缘关系最近,核苷酸同源性为100%;与柯萨奇病毒A24型变异株原型株EH24/70的核苷酸同源性为84.5%;与柯萨奇病毒A24原型株Jospeh的核苷酸同源性为76.3%。结论本次急性出血性结膜炎爆发流行的病原体是柯萨奇病毒A24型变异株,毒株可能来源于同时期广东省流行的株型。     

隐孢子虫PCR检测体系的建立及其应用

目的建立快速检测隐孢子虫卵囊的PCR检测体系,以期在人群和食品及其饮用水腹泻原虫监测中推广应用。方法以隐孢子虫小亚基SSU r RNA和卵囊壁蛋白(COWP)为靶基因,设计巢式PCR和荧光PCR的引物和探针;以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,分别进行两种检测方法的敏感性和特异性试验;再用某水牛养殖场采集的58份牛粪样考核检测体系的应用价值。结果设计的巢式PCR引物和荧光PCR引物探针特异性都很高,巢式PCR对隐孢子虫DNA的检测最低OD阈值为2 pg隐孢子虫DNA;实时荧光PCR显示最低检测阈值为200 fg隐孢子虫DNA,灵敏性都比较高,实时荧光PCR的灵敏性比巢式PCR高1个数量级(10倍);58份检测样本中,有一份为阳性样本,PCR产物经序列分析显示为微小隐孢子虫。结论巢式PCR和实时荧光PCR检测隐孢子虫的特异性和灵敏性均高,操作简便,能为隐孢子虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段和方法依据。奶牛感染人兽共患微小隐孢子虫基因亚型,具有人兽共患传播的可能性。     

人参皂苷Rg3对低密度脂蛋白诱导的肾小球系膜细胞TGF-β/Smad/NF-κB通路及细胞凋亡的影响

目的:分析人参皂苷Rg3对低密度脂蛋白(LDL)诱导人肾小球系膜细胞(HMC)转化生长因子-β/Smad/核因子kappa B(TGF-β/Smad/NF-κB)通路及细胞凋亡的影响。方法:将HMC细胞分为对照组(不做任何处理)、LDL组(40μg/ml的LDL处理)、人参皂苷Rg3低浓度组(LDL 40μg/ml+人参皂苷Rg315μmol/L)、人参皂苷Rg3中浓度组(LDL 40μg/ml+人参皂苷Rg330μmol/L)、人参皂苷Rg3高浓度组(LDL 40μg/mL+人参皂苷Rg360μmol/L)。采用MTT法检测HMC细胞增殖活性;Western Blotting法检测通路相关蛋白TGF-β、Smad2、Smad3、NF-κB以及B淋巴细胞瘤基因相关x蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤基因-2(Bcl-2)和半胱天冬酶-3(Caspase-3)细胞凋亡相关蛋白的表达水平。结果:与对照组相比,LDL组HMC细胞增殖活性、TGF-β、Smad2、Smad3、NF-κB蛋白表达水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.01);与LDL组相比,人参皂苷Rg3低、中、高浓度组HMC细胞增殖活性、TGF-β、Smad2、Smad3、NF-κB、Bcl-2蛋白表达水平明显降低,HMC细胞凋亡率、Bax和Caspase-3的蛋白水平明显升高,并呈浓度依赖性,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:人参皂苷Rg3可抑制LDL诱导的HMC细胞增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与TGF-β/Smad/NF-κB信号通路密切相关。     

深圳市啮齿动物感染汉坦病毒的基因特征研究

目的 研究深圳市啮齿动物所携带的汉坦病毒分子流行病学特征,分析汉坦病毒基因型别。方法 采用笼日法布点捕鼠,收集鼠肺标本后研磨提取RNA。运用实时荧光PCR方法进行分型检测,进一步采用反转录-巢式PCR扩增部分M片段G2区和S片段核苷酸序列,并进行同源性和系统进化树分析。结果 共捕获200只鼠类动物,包含褐家鼠189只、黄胸鼠9只和小家鼠2只。汉坦病毒检出率为21.0%（42/200）,均为汉城病毒,其中宝安区鼠肺检出率最高,达45.7%（χ²=25.60,P<0.05）。从阳性鼠肺标本中分别扩增出25条汉坦病毒M片段G2区和S片段序列,核苷酸同源性分别为95.3%~100.0%和97.6%~100.0%,与来自广州市的参考序列核苷酸相似性较高。系统进化树显示此次研究深圳市鼠类动物所携带的汉坦病毒均为汉城病毒的S2亚型。氨基酸突变位点分析发现,在S基因编码的核衣壳蛋白中存在1个位点突变,为BA-111第973位由丙氨酸（Ala）变为苏氨酸（Thr）。结论 深圳市鼠类动物所携带的汉坦病毒为汉城病毒的S2亚型,与深圳市历年以及周边省市汉坦病毒代表病毒毒株相比变异不大。     

湖南郴州地区年轻女性宫颈炎症患者的病原学研究

目的了解郴州拟诊为宫颈炎患者的病原体感染情况。方法获取2007年11月～2010年4月在郴州第一人民医院等医院普通妇科门诊及妇女保健门诊就诊的女性184例,采用培养或PCR检测方法,对其进行解脲脲原体（Ct）等多种病原检测,同时选取健康检查和孕前检查的女性128名作为对照。结果在184例宫颈炎患者中,检出病原体157例,检出率为85.33%。以Uu检出率为最高,混合感染者达26例。结论郴州地区在性病门诊就诊的宫颈炎患者体内能检测出多种常见病原体,并且相当部分患者存在两种或两种以上病原体混合感染。     

硒蛋白K在小鼠中的组织差异表达及T淋巴细胞内定位

目的检测硒蛋白K(Sel K)在小鼠脾、肾、肠、肺、脑、肝组织中的表达差异及在T淋巴细胞内的定位,为研究Sel K的分布与生物学功能的关联性提供参考。方法采用实时荧光定量PCR,Western blot以及免疫组化方法检测硒蛋白K在小鼠各组织的表达差异,并采用细胞免疫化学的方法 ,用激光共聚焦显微镜观察硒蛋白K在小鼠T淋巴细胞内的定位。结果实时荧光定量PCR结果显示硒蛋白K在小鼠各组织中均有表达,并且在脾脏中的表达明显高于其他组织(P0.05)。Western blot及免疫组化结果与实时荧光定量PCR结果基本一致。细胞免疫化学结果显示硒蛋K在小鼠T淋巴细胞中定位于内质网。结论硒蛋白K是一种在脾脏中高表达的内质网蛋白。     

深圳市2008-2009年A型H1N1季节性流感病毒神经氨酸酶抑制剂耐药性监测

目的 对深圳市2008-2009年分离到的H1N1季节性流感病毒神经氨酸酶(NA)抑制剂的耐药性进行监测.方法 根据原始临床样本的采集时间,按周抽取了55株2008-2009年分离到的H1N1季节性流感病毒,对其NA片段进行全长测序,选取WHO推荐的疫苗株和部分国内外分离到的H1N1季节性流感病毒作为参考株,运用Mega3.1软件进行种系发生树的构建、耐药相关位点及糖基化位点的分析.结果 对NA片段的序列分析发现2008年有2株(7.1%)出现了H275Y突变,但是2009年则有25株(92.6%)出现了该突变.提示H275Y达菲耐药突变株成为了2009年深圳市社区传播的优势株.同时还发现了一株Q136K变异株,显示对乐感清出现耐药.分子进化分析结果显示,H275Y变异成为了毒株在系统进化树上分布的主要依据.所有的深圳株NA片段上潜在的糖基化位点序列保守.结论 大量H275Y达菲耐药株的出现提示在今后的工作中应当密切关注流感病毒的耐药进展,进一步加强其耐药机制的研究.

Abstract：

Objective To analyze neuraminidase(NA) inhibitor resistance of seasonal H1N1 influenza A viruses isolated in Shenzhen during 2008 to 2009. Methods The NA gene of these viruses were sequenced. Phylogenetic analysis of the sequences was performed with Mega3. 1 software. Results In 2008, most isolates of the seasonal H1 N1 virus were susceptible to neuraminidase inhibitors, but the H275Y mutation in the neuraminidase gene region associated with high-level oseltamivir resistance had been detected in 92.6% of the strains isolated in 2009. Furthermore, a strain with Q136K was found, which showed the resistance to Zanamivir. Conclusion In the light of emerging resistance, close monitoring and understanding of the nature and dynamics of resistance mutations in influenza virus should be a priority.     

2009年广东省深圳市B型流感病毒系统进化及分子变异分析

目的 了解2009年深圳市B型流感病毒的系统进化及分子变异情况。 方法 对2009年深圳市分离的B型流感病毒的时间分布进行统计分析,并通过MEGA等软件对其HA1基因的系统进化及分子变异情况进行研究。 结果 深圳市2009年1-10月均有B型流感病毒流行,3-5月为流行高峰;Victoria系分支D的毒株是优势流行株;与2008 - 2009年度的国际疫苗株相比,Victoria和Yamagata系的HA1分子在其抗原决定簇区均出现了多个氨基酸位点的变异。 结论 2009年深圳市B型流感病毒的流行时间长,一些氨基酸位点的变异并没有导致一个新流行株系的形成。