体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的特征及功能

目的：观察人骨髓间充质干细胞体外培养定向分化为肝细胞样细胞的过程及其特征。方法：实验于2003—12／2004—05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成。人骨髓取自髂后上嵴骨髓穿刺的健康供者，来源于中山大学附属第二医院儿科患儿健康家属。全骨髓贴壁筛选法分离出骨髓间充质干细胞，体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增5代的骨髓间充质干细胞，分为2组，分化组于加入20μg／L肝细胞生长因子和10μg／L成纤维细胞生长因子4的opti-MEMI低血清培养基中诱导分化，空白对照组则不加任何细胞因子。2周后，行细胞形态学观察，并检测成热肝细胞的糖原合成和尿素分泌功能(免疫细胞化学法检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19表达，反转录-聚合酶链式反应检测甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA转录水平，高碘酸-Schiff染色检测糖原及紫外分光光度法测定尿素氮合量)。结果：①流式细胞仪显示第5代骨髓间充质干细胞高表达表面抗原白细胞分化抗原29，不表达白细胞分化抗原34，11b。②分化组骨髓间充质干细胞至第14天，部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞。③免疫细胞化学法检测到细胞特异性表达甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18，19，反转录-聚合酶链式反应显示有甲胎蛋白和白蛋白mRNA转录。④高碘酸-Schiff糖原染色可见胞浆内存在红色颗粒，呈阳性反应，培养液内尿素氮含量亦明显升高。⑤空白对照组骨髓间充质干细胞则未见上述各项变化。结论：在低血清培养体系中，采用成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子联合诱导，证明人骨髓间充质干细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞，诱导后的骨髓间充质干细胞上有了成熟肝细胞的糖原合成和分泌尿素的特征性功能，表明骨髓间充质干细胞可作为肝细胞移植和人工肝的新型种子细胞。     

肺表面活性物质防治急性呼吸窘迫综合征的实验研究

目的：探讨肺表面活性物质（pulmonary surfactant,PS)对内毒素诱发大鼠急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS)的防治作用。方法：48只健康雄性SD大鼠，手术并给予机械通气后随机分为6组：健康对照组（H组），ARDS模型组（M组），其余动物根据动脉血氧分压（PaO2)/FiO2比值分2个时期（PaO2/FiO2≤300mmHg早期－E、PaO2/FiO2≤200mmHg晚期－L）和所给猪肺PS分2个剂量（50mg/kg,100mg/kg），两两组合成E50、E100、L50和L100 4组。用PS后共观察6h。结果：M组和L50组的PaO2和静态胸肺压力－容积（P－V）曲线肺容积均较H组明显降低（P＜0．01），L100组上述指标明显高于M组（P＜0．05），而E50组和E100组PaO2和P－V曲线肺容积均较L100组进一步升高（P＜0．05，P＜0．01），E50组和E100组间上述指标差别不明显。支气管肺泡灌洗液（BALF）分析示L50组和L100组饱和卵磷脂（DSP)/总蛋白（TP）、TP和最小表面张力（STmin)均较M组改善（P＜0．01），但STmin仍高于H组（P＜0．01），E50组和E100组的BALF测值均明显优于L100组（P＜0．01），且STmin接近H组。结论：早期应用PS疗效明显优于晚期，且所需剂量较小，可能是防治ARDS的有效手段之一。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为肝细胞样细胞的特征及功能

目的:观察人骨髓间充质干细胞体外培养定向分化为肝细胞样细胞的过程及其特征。方法:实验于2003-12/2004-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成。人骨髓取自髂后上嵴骨髓穿刺的健康供者,来源于中山大学附属第二医院儿科患儿健康家属。全骨髓贴壁筛选法分离出骨髓间充质干细胞,体外扩增后以流式细胞仪鉴定其表面标志。取扩增5代的骨髓间充质干细胞,分为2组,分化组于加入20μg/L肝细胞生长因子和10μg/L成纤维细胞生长因子4的opti-MEMI低血清培养基中诱导分化,空白对照组则不加任何细胞因子。2周后,行细胞形态学观察,并检测成热肝细胞的糖原合成和尿素分泌功能(免疫细胞化学法检测甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18,19表达,反转录-聚合酶链式反应检测甲胎蛋白、白蛋白基因mRNA转录水平,高碘酸-Schiff染色检测糖原及紫外分光光度法测定尿素氮合量)。结果:①流式细胞仪显示第5代骨髓间充质干细胞高表达表面抗原白细胞分化抗原29,不表达白细胞分化抗原34,11b。②分化组骨髓间充质干细胞至第14天,部分细胞分化为多角形的肝细胞样细胞。③免疫细胞化学法检测到细胞特异性表达甲胎蛋白、白蛋白及细胞角蛋白18,19,反转录-聚合酶链式反应显示有甲胎蛋白和白蛋白mRNA转录。④高碘酸-Schiff糖原染色可见胞浆内存在红色颗粒,呈阳性反应,培养液内尿素氮含量亦明显升高。⑤空白对照组骨髓间充质干细胞则未见上述各项变化。结论:在低血清培养体系中,采用成纤维细胞生长因子4和肝细胞生长因子联合诱导,证明人骨髓间充质干细胞在体外能定向分化为肝细胞样细胞,诱导后的骨髓间充质干细胞上有了成熟肝细胞的糖原合成和分泌尿素的特征性功能,表明骨髓间充质干细胞可作为肝细胞移植和人工肝的新型种子细胞。     

P21Cip/WAF1及P27Kip1与增殖细胞核抗原在人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中的表达

背景:P21CIp/WAF1、P27Kip1是两种重要的细胞周期的负调控因子,增殖细胞核抗原是反映干细胞增殖的指标.目的:观察体外诱导人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化过程中P21Cip/WAF1,P27KIp1及增殖细胞核抗原的表达变化.设计、时间及地点:细胞学基因水平观察,于2006-12/2007-06在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心实验室完成.材料:骨髓来源于中山大学附属第二医院行骨髓穿刺的健康供者.方法:全骨髓贴壁筛选法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第5代后,加入含20 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维细胞生长因子4的opti-MEM I低血清培养基向肝细胞诱导分化.主要观察指标:诱导后RT-PCR检测细胞内P21Cip/WAF1,P27 KIp1及增殖细胞核抗原基因mRNA的表达.结果:骨髓间充质干细胞向肝细胞定向诱导后0,1,3,5,7 d,细胞内P21CIp/WAF1 mRNA表达的相对量逐渐升高(P＜0.01),P27Kip1 mRNA表达的相对量无明显差异(P＞0.05),增殖细胞核抗原mRNA表达的相对量除诱导后0,1 d无明显差异(P＞0.05)外,其余各时间点均逐渐降低(P＜0.01).结论:P21 CIp/WAF1高表达抑制了骨髓间充质干细胞增殖,同时在其向肝细胞分化过程中起一定调控作用,P27KIp1可能并不起作用,增殖细胞核抗原的表达则与P21Cip/WAF1相反,呈逐步减少趋势.     

转乙型肝炎病毒x基因肝癌细胞株的建立

目的 建立表达转乙型肝炎病毒Ｘ基因（ＨＢＸ）的人肝癌细胞株,为研究ＨＢＸ基因与肝癌生物学行为间的关系提供模型。方法 以聚合酶链反应（ＰＣＲ）法从３．２ｋｂ 型肝炎病毒（ＨＢＶ）全基因组中主增ＨＢＸ基因,亚克隆至逆转 功体,磷酸钙共沉淀法将其导入包装细胞系,以含病毒的培养上清感染人肝癌细胞系ＱＧＹ７７０１,新霉素（Ｇ４１８）筛选,ＰＣＲ与反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）鉴定。结果 ＰＣＲ法从ＨＢＶ基因     

原发性肝癌尿激酶和尿激酶受体表达的研究

目的　研究肝癌尿激酶和尿激酶受体的表达 ,探讨肝癌侵袭和转移分子机制。方法　应用酶联免疫吸附试验 (ELISA)和放射配基结合试验分析 12例肝癌及癌旁组织中尿激酶和尿激酶受体的表达。结果　肝癌组织中尿激酶水平为 (777± 5 86 ) pmol/g蛋白 ,细胞表面尿激酶受体数量为(6 49± 2 2 3) pmol/ g蛋白 ,均显著高于癌旁组织 [(84± 5 7)pmol/ g蛋白和 (72± 30 ) pmol/g蛋白 ,P <0 .0 1];肝癌细胞尿激酶与尿激酶受体的高亲和力 (0 .33± 0 .18)比癌旁组织 (6 .6 3± 2 .17)更高 (P <0 .0 1)。结论　肝癌组织中尿激酶与尿激酶受体过量表达 ,这可能在肝癌的侵袭和转移过程中起重要作用。     

体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝细胞横向分化

近期研究证明，某些骨髓干细胞可以分化成为肝细胞或胆管细胞^[1，2]，这些发现具有重要的临床应用价值，如用其来作为生物人工肝或肝细胞移植的供体细胞，以解决供体缺乏，同时自体细胞还可免除异基因或异种细胞所致的许多不便。为此，作者通过肝细胞生长因子(HGF)、上皮细胞生长因子(EGF)体外诱导骨髓干细胞向肝细胞分化的研究，探索骨髓干细胞横向分化为肝细胞的作用机制。     

丁酸钠增强未成熟树突状细胞表达吲哚胺2,3双加氧酶抑制T细胞增殖

目的 观察丁酸钠诱导的不成熟树突状细胞(DCs)吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)的表达及其在抑制T细胞免疫反应中的作用.方法 用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4诱导人单个核细胞来源的未成熟DCs,6 d后分别加入丁酸钠、脂多糖(LPS)和多细胞因子鸡尾酒组合[肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-6、IL-1β、前列腺腺素E2(PGE2)],24h后收集DCs;流式细胞仪检测Des表型,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR检测IDO mRNA的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-12分泌;混合淋巴细胞培养(MLR)检测各组DCs对同种异体T淋巴细胞增殖的影响.结果 丁酸钠诱导的DCs呈现典型未成熟DCs的特征,低表达CD83、CD80和HLA-DR,分泌IL-12水平低.与对照组比较,丁酸钠组和LPS组DCs的IDO mRNA的表达分别升高了(32.03±4.02)倍和(1.01±0.43)倍,而鸡尾酒组则降低(3.31±1.07)倍,差异有统计学意义(P<0.01);丁酸钠诱导的未成熟DCs采用IDO抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT)处理后,可以有效刺激T细胞增殖,但其能力仍低于LPS或鸡尾酒法诱导的成熟DCs.结论 丁酸钠可显著增强未成熟DCs的表达IDO,并且IDO过表达在其抑制T细胞增殖中起重要作用.     

急性肠系膜缺血性疾病15例诊治分析

目的 探讨急性肠系膜缺血性疾病的临床特点及其诊断和治疗方法.方法 回顾性分析15例急性肠系膜缺血性疾病患者的临床资料.结果 14例行手术治疗,9例存活,5例死亡;保守治疗1例成活.结论 选择性血管造影对早期诊断急性肠系膜缺血性疾病有重要临床意义,早期切除坏死肠管及术后抗凝治疗是防止复发、降低死亡率的有效措施.     

B7-H1阻断对未成熟树突状细胞免疫功能的影响

目的：探讨B7-H1阻断对未成熟树突状细胞(DCs)的免疫刺激活性的影响。 方法： 以细胞因子GM-CSF和IL-4体外诱导人单核细胞来源的树突状细胞，流式细胞仪检测在诱导过程中B7-H1的表达，并以B7-H1单抗阻断处理，分别以流式细胞仪、MTT法、ELISA、ELISPOT法检测B7-H1阻断对DCs的成熟和内吞能力、刺激淋巴细胞增殖、IL-12的分泌、诱导淋巴细胞分化的影响。 结果： DCs在诱导过程中B7-H1表达逐渐增强，第7 d时的阳性表达率为54.12％，以TNF-α诱导成熟后阳性表达率为83.64％；B7-H1阻断对DCs成熟和内吞能力无影响，但可使未成熟DCs刺激淋巴细胞增殖的能力和IL-12的分泌明显增强，并诱导淋巴细胞向分泌IFN-γ的Th1/Tc1的分化。 结论： B7-H1阻断可增强未成熟DCs的免疫刺激活性，利用B7-H1阻断的DCs瘤苗激发抗肿瘤免疫的方案值得进一步探讨。